Toll样受体参与心肌缺血再灌注损伤的研究进展

[关键词] 心肌缺血再灌注损伤；Toll样受体；缺血后适应

中图分类号：R54 文献标识码：A 文章编号：1009-816X（2015）03-0224-03

再灌注治疗在急性心肌梗死患者中应用逐渐增多，其引发的再灌注损伤日益受到人们的重视，对其发生机制进行了积极的探索研究，近年来研究发现，固有免疫的成员之一Toll样受体在心肌缺血再灌注损伤的炎症反应中起了重要作用，本文就Toll受体在心肌缺血再灌注损伤中的作用及发生机制展开综述。

1 TLRs概述

Toll样受体家族（TIRs）是最早被人类认识的免疫细胞的模式识别受体（PRRS），TIRs最初发现是果蝇背腹侧蛋白质，随后发现其是参与免疫反应的重要成员。TIR与病原体相关模式分子（PAMP）或损伤相关模式分子（DAMP）结合后，通过转录因子（NF-kB）和丝氨酸/苏氨酸（MAP）激酶相关信号途径，引起多种促炎症因子的激活，通过炎症反应清楚病原体感染。然而，过量出现的炎症介质可能导致局部和全身性疾病，包括IPS引起的内毒素休克。为此免疫系统必须启动相应的机制，对TIR介导的炎症应答实施调节。到目前为止，已发现10种TIRs表达于人类，13种TIRs表达于小鼠，其中TIR1、TLR2、TIR4～6、TIR10～ 13在细胞表面表达，而TLR3、TIR7～9在细胞器上表达。前者主要识别病原表面某些共有特定的分子结构，如G+菌的肽聚糖、磷酸和G-菌的鞭毛蛋白等；后者主要识别胞质中病毒双/单链RNA和胞质中细菌或病毒非甲基化CpG DNA，进而通过触发MyD88依赖或非依赖的信号转导途径，诱导产生促炎细胞因子和I型干扰素。TLRs不仅表达于单核细胞、中性粒细胞等各种免疫细胞，还在心肌细胞、内皮细胞、外膜纤维原细胞等实质细胞中均有表达。目前对其在心脏分布和功能的研究尚不完全明确，近期在成人心脏组织中研究发现10种TLRs的mRNA，其表达相对水平是TIR4> TIR2>TLR3>TLR5>TLRl>TIR6>TIR7> TIR8> TLR9> TIRlO，Tian等采用免疫组织化学和免疫印迹发现心肌细胞表达TLR2和TIR4蛋白。采用基因敲除手段敲除TLR2或TLR4后对TIR2或TLR4进行功能学研究，发现TIR2及TIR4都在一定程度上参与了心血管疾病的免疫应答。但是至少可以确认的一点是心肌细胞表达TLR2和TIR4基因及蛋白，并能识别PAMPs和DAMPs启动免疫应答。

2 TLR与心肌缺血再灌注损伤

心肌缺血/再灌注损伤（myocardial ischemia/reper-fusion injury，MIRI）的概念首先由Tennings提出，表现为恢复缺血心肌的血供后组织损伤加重，甚至发生不可逆损伤的现象，其损伤包括心肌顿抑、无复流现象、再灌注心律失常、致命再灌注损伤等。心肌缺血再灌注损伤的发生机制，尚未完全阐明。一些研究表明固有免疫在MIRI的发病机制中起重要作用，而TLRs是固有免疫的基本成员，介导一系列重要的免疫应答，所以猜想Toll样受体可能通过影响自由基、细胞内钙超载和白细胞的激活来参与影响心肌缺血再灌注损伤的发生。MIRI会增加炎症介质的表达如肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）和一氧化氮（N0）等，而强烈表达的炎症因子对心脏产生明显的负性作用，主要表现在心室功能紊乱，近些年的研究表明，再灌注损伤的心肌可通过TRL-2、TLRR-4介导的信号来影响心室功能紊乱的严重程度。心肌细胞的体外研究提示，过氧化氢诱导的氧化应激可明显增加TLR-2参与介导的信号，此信号途径亦可被TLR-2抗体阻滞，sakata等人已证明TLR2-TIRAP信号途径促进MIRI的进展，并诱导成人左心室功能紊乱。

一些体外实验表明，TLR2缺陷的心肌可以明显衰减左心室舒张压（LVDP）的恢复，尽管是体外实验，但至少可以提示，心室功能紊乱与TIR2有一定关联。TIR2缺陷的骨髓移植在野生型小鼠，其心肌梗死面积与TIR2缺陷小鼠的大致相同，但用正常小鼠骨髓移植在TLR2缺陷小鼠并不能减轻再灌注损伤，此外用TIR2抗体治疗的小鼠可减轻心肌炎症、细胞凋亡，TLR2阳性的白细胞也许可以决定MIRI的严重程度。TIR信号通路参与MIRI的机制除了炎症反应外，与心肌细胞凋亡也有关。已有研究证明TIR2和TIR4与凋亡和生存通路有关。在TIRs家族中，基于目前的研究认为TLR-2、TIR-4与MIRI的发生最为密切。在MIRI时TIR2和TLR4通过识别不同的损伤性配体激活信号通路，激活后可引起不同的损伤表现，但TIR2和TIR4通路可能存在着交叉和共同径路，从而具有协同和扩大损伤效应的作用。循环中的白细胞TIR和心肌细胞TIR参与MIRI的途径与方式有所差异，但在功能上可能起到相互完善和互补的作用，在MIRI时，损伤性配体一部分可直接被心肌TIR识别并激活，另一部分进入循环激活白细胞TIR，从而产生一些列的趋化因子，促进炎症因子和白细胞的聚集，促进炎症反应，同时也可能活化了心肌TIR，使MIRI加重。白细胞TLR起到免疫监视的作用，并传递信号给心肌TIR，心肌TIR活化后作为主力军产生一些列的损伤作用，它们共同形成完整的损伤体系。

TIR介导的信号通路有两个，包括MyD88和TRIF依赖途径，它们可能都参与调节MIRI。Kac-zorowski发现敲除小鼠心脏中的MyD88和TRIF，再灌注损伤后其血清中TNF-a、IL-6、IL-1、细胞间黏附分子（ICAM-1）和单细胞趋化因子（MCP-1）明显减少，NF-KB是TIR-4调节信号通路的下游转录因子，被激活后进入细胞核，正性调节促炎细胞基因的表达。Yang和jiang在使用血管紧张素2受体阻滞剂（缬沙坦）预处理大鼠时，发现可减少TIR4和NF-KB的表达并改善MIRI。MIRI的发生不仅通过TIR4信号通路，也可通过与TIR信号通路相关的其它途径，如P13/AKt信号通路、AMPK和EPK通路。zhao在实验中发现，C3H/Hej（TIR4缺陷）鼠较野生型，其ERK和AMPK的信号表达更强，其离体心肌细胞抵抗收缩功能紊乱的能力更强，这可能与AMPK、ERK信号通路在C3H/Hej心脏的低氧活化能力更强有关，考虑TLR4信号可能抑制AMPK和ERK通路来实现MIRI。另一条TLR4/P13K/AKt依赖通路也可能参与MIRI的发生，在TIR4（-）小鼠中使用P13K抑制剂，其再灌注损伤不能得到改善，认为P13k/AKt可能通过增加磷酸化作用、心肌磷酸酶的失活、心肌糖原合成酶-3的失活来介导MIRI。MIRI中免疫细胞和非免疫细胞会释放一些内源性配体，与TIR结合而激活各种固有免疫应答，应答过程受MyD88、TRIF途径和其它相关通路的影响，最后通过激活NF-kB促进炎症反应。

3 TLRs 与心肌缺血预适应、后适应

现已有大量的实验研究证明心肌缺血预适应（IPC）、后适应（IPOC）可通过降低心肌梗死面积，减少细胞凋亡，改善内皮功能及减轻心肌缺血组织水肿，对心肌缺血再灌注损伤发挥保护作用。而近些年来研究者猜想心肌缺血预适应、后适应IPC可能通过TLR2一TIRAP依赖途径实现细胞保护作用，实验中发现，预处理的野生型小鼠适应可能通过TIR起到减轻MIRI的作用。Izuishi等实验证明，用HMGB1预处理的野生型小鼠，其肝的再灌注损伤与TIR4突变的小鼠相比明显减轻，且肝细胞得到一定保护。此外在大脑缺血再灌注的研究中，用TIR-2特效配体预处理的小鼠可降低其脑梗范围。Dong等实验中发现预处理的野生型小鼠其左心室舒张压恢复率明显提高，心功能亦明显改善。用TLR2兴奋剂Pam3 CSK4可复制出小鼠缺血预适应的效果，但TIR-2缺陷小鼠则不能，Mersmann等也发现，通过Pam3 CSK4预处理可减少心梗面积和肌钙蛋白T的释放。Ponce等发现美洲锥虫病患者的心脏细胞上TLR2的表达高于正常人，TIR2激活后促进IL-6的分泌，发挥抗凋亡作用。缺血再灌注损伤后，采用LPS预处理可激活Pl3k/AKT信号通路减轻心肌细胞凋亡和心肌梗死面积。IPS预处理培养的心肌细胞后激活PI3k/AKT" ERK、IKB-β发挥抗凋亡效应来减轻心肌细胞缺氧再复氧损伤，IPS预处理未改善TIR4和MyD88基因敲除小鼠的心功能，提示TIR4和MyD88参与该机制。缺氧再复氧损伤的心肌细胞释放外源性配体HSP60经TIR4/NF-KB通路减轻心肌细胞凋亡。大量的研究提示预适应能够减轻再灌注损伤，但由于其临床应用受到限制，近年来心肌缺血后适应越来越受到人们的追捧，不少文献肯定了其减轻再灌注损伤的作用，缺血后适应的分子机制成为研究的热点，近期的一项国内研究发现，通过闭塞大鼠的大脑中动脉形成脑梗死，分别在闭塞2、3、4、4.5和6小时后给予5个循环的缺血（lOs）——灌注（lOs），结果发现缺血2、3、4小时的三组，其脑梗死面积、脑水肿程度、脑功能都得到一定程度的改善，实时RT-PCR检测发现TIR2、TIR4的表达亦减少，所以猜想Toll样受体也可能参与心肌缺血后适应的分子机制，其基础就在于TIR在MIRI中起着重要作用，而缺血后适应使TLR的损伤性配体减少，减弱TIR信号通路的激活，进一步减轻MIRI，但目前对两者的相关性研究较少，需进一步研究证实。

4 展望

大量的文献研究提示Toll样受体（尤其疋TIR2、TIR4）参与介导心肌的缺血/再灌注损伤，关于其分子机制有了一定认识，但仍然有许多疑问没有解释清楚，如感染时，Toll样受体可以保护心脏并限制组织损伤，为什么在非感染刺激时TIRs会增加损害性的炎症反应，并加重组织损伤，由此可见免疫系统的激活具有“双刃”效应 完整的免疫系统在机体的许多保护途径中是必需的，而长期的免疫激活也可能激活“不利”的信号级联反应而致疾病发展。当前面临的主要挑战就是在限制有害的先天免疫反应的同时如何保持足够、适当的先天免疫防御机制。因此研究能否将后适应与优化TIR完美结合，从而探寻安全、有效的减轻再灌注损伤的方法还需要进一步深入研究。

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