过量运动对大鼠心肌细胞钙离子通道的影响

摘要:研究过量运动对心室肌细胞钙离子通道的影响,旨在进一步探讨其在心肌损伤中的意义。制备离体心室肌细胞并用去甲肾上腺素(NE)诱导建立类似过量运动所产生的应激心肌细胞模型,应用流式细胞术(FCM)和Fura2荧光分光光度法测定应激心室肌细胞的凋亡率和心肌细胞内游离钙浓度变化。FCM检测发现10-4mol/L的NE模拟应激可导致心室肌细胞凋亡率明显上升,对照组:0.41%,应激组:2.57%(P<0.01)。实验组心肌细胞异常活动可能导致钙超载,从而引起心肌细胞凋亡,导致应缴性心肌损伤的发生。

关键词:钙离子通道 过量运动 心肌细胞 细胞凋亡

前言

应激是指机体在内外界环境的有害因素刺激下,机体所产生的全身非特异性反应,主要表现为交环灌流10～15min,至心脏柔软膨大为止。过量运动可引起机体的应激反应,过度的应激反应可引起机体包括心血管系统在内的多种系统发生病交,导致心肌功能严重受损。然而对于此类疾病的发病机制尚不清楚,尤其对于心肌细胞离子通道在其中所发挥的作用及意义鲜有报道。钙离子参与多种生命活动过程钙通道广泛存在于机体的各种类型组织细胞中,并且在不同的组织细胞,或同一组织细胞不同部位其钙通道的类型及生理功能各不相同。钙离子通道是细胞膜上的一类特殊亲水性蛋白质微孔道,是神经、肌肉细胞电活动的物质基础。随着分子生物学的发展,人们对钙离子通道的分子结构及特性有了更加深入的认识,并发现其功能、结构异常与许多疾病的发生和发展有关。细胞膜上有很多Ca+2通道来调节细胞内的Ca+2的平衡。TRPM8是一种非选择性阳离子通道,属于TRP蛋白的TRPM亚族。其他两个亚族是TRPC和TRPV家族。心肌细胞膜TRPM8钙离子通道对心肌细胞的正常生理功能有重要的意义。本文研究应激对心肌细胞膜TRPM8钙离子通道的影响,旨在进一步探讨其在心肌损伤中的意义。

1、材料与方法

1.1实验材料

Wistar大鼠购自湖北省卫生防疫站。

1.2实验方法

1.2.1大鼠心室肌细胞的制备

取雄性成年200～250g体重Wistar大鼠,断头、开胸,迅速取出心脏,于4℃无钙台氏液中(mmol/L):NaCI 116、KCI 5.4、NaH2PO4 1.4、NaH2 C03 15、MgS04 1、葡萄糖15、HEPES 5,用NaOH调pH值至7.4。小心去除脂肪以及结缔组织,将主动脉用棉线固定于Langendroff灌流装置上,事先预热至37℃的无钙台氏液灌流5min去除淤血后,再用C02的混合气饱和并恒温至37℃。剪下心室部分于KB液(mmol/L:L2谷氨酸70、KCL25、牛黄酸20、KH2 P04 10、MgCl2 3、HEPES 10、葡萄糖10、EG2TA 0.5(KOH调pH至7.4)中剪碎,轻轻吹打,经细尼龙网(孔径105μm)过滤,细胞存活率达80%以上,最后细胞悬液置4℃冰箱保存1h备用。

1.2.2大鼠心室肌细胞应激模型的建立

去甲肾上腺素(noradrenaline,NAD)主要激动α受体,对β受体激动作用很弱,具有很强的血管收缩作用,使全身小动脉与小静脉都收缩(但冠状血管扩张),外周阻力增高,血压上升。兴奋心脏及抑制平滑肌的作用都比肾上腺素弱。临床上主要利用它的升压作用,静脉滴注用于各种休克(但出血性休克禁用),以提高血压,保证对重要器官(如脑)的血液供应。应激定义为机体在心理、环境或者物理应激原刺激下,激活下丘脑—垂体—肾上腺轴和交感神经系统导致生理的变化或适应。模拟应激状态下机体去甲肾上腺素分泌水平的上升,分别以含10-4、10-5、10-6mo1/L NE的细胞外液(mmol/L):(氯化胆碱120、CsCl4、CaCl2 1.8、MgCl2 2、HEPES 10、Glucose 10,以Tris 调pH至7.4)灌流心室肌细胞10 min,诱导建立应激心肌细胞模型。

1.2.3流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡

流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。其特点是:①测量速度快,最快可在1秒种内计测数万个细胞:②可进行多参数测量,可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量,并具有明显的统计学意义;③是一门综合性的高科技方法,它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果;④既是细胞分析技术,又是精确的分选技术。

用PBS洗细胞两次,离心收集约5×105细胞,用含5%胎牛血清PBS重悬细胞,加入无水乙醇0.7 m1,混匀,-20℃固定24 h以上。2000×g离心5min,弃上清,用PBS洗两次,加RNase至终浓度50 g/L溶于0.15 mmol/L NaCl、0.1mmol/L Tris-HCl(pH7.5),4℃冰浴30 min。细胞用PI染色,在激发光488nm波长下进行检测,每样品计数10000个细胞。

1.2.4 TUNEL法检测细胞凋亡

细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程,染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30%的染色体DNA在Ca 2+和Mg2+依赖的核酸内切酶作用下,在核小体单位之间被随机切断,形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3,-oH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3,-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3,-OH形成,很少能够被染色。低分子量的DNA分离后,也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译(nick translation),使低分子量的DNA标记或染色,然后分析凋亡细胞。TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高,因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。

甲醛固定后的细胞爬片入80%酒精5 min,双蒸水冲洗,5 mg/L蛋白酶K 37℃15 min,双蒸水漂洗后,加标记缓冲液,于冰上取1/10体积TdT,1/10体积Bio-dU TP及4/5体积标记缓冲液,混匀后滴加于样品上,37℃1 h,TBS洗4×5min。加封闭液,室温下10min后甩掉。加HRP-SA( 1:50),37℃45 min,TBS洗3×5 min。DAB显色10 min左右,苏木精浅染核,甘油明胶封片。凋亡细胞的胞核呈不同程度的圃缩状态,染成玫瑰红色。

1.2.5心肌细胞钙稳态的变化测定

Fura-2是一种广泛使用荧光钙离子探针。结合钙离子后,荧光的最大激发波长从363nm(末结合钙离子时)迁移到335nm(钙离子饱和时),同时荧光的发射最大波长在510nm左右,相对未变。探针分别在340nm和380nm波长光处被激发,通过使用与两种激发对应的荧光强度比率来计算细胞内的钙离子浓度。钙离子浓度测量使用比率法避免了不均匀染色和光致漂白的干扰。Fura-2已在很多细胞系统和应用中使用,尤其是在显微成像技术里。采用Fura2荧光分光光度法测定心肌细胞内Ca2+的含量,细胞经Fura2负载后,利用F4500行荧光分光光度计(日立)进行荧光强度测定,激发波长为340nm,发射波长为510nm。

1.2.6统计分析

统计学方法所得数据用均数士标准差(x士s)表示,用SPSSl3.0软件进行统计学处理,全部数据经方差齐性分析后,采用单因素方差分析或配对t检验进行显著性检验,P<0.05判断数据有统计学意义。

2、结果

2.1流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率

分别以l0-6、10-5、10-4mol/L NE处理心室肌细胞,利用流式细胞仪检测各组心肌细胞的凋亡率,分别为0.48%、0.61%、2.57%,较之于对照组0.41%,10-4mol/L组凋亡率显著上升(P<0.05)。

2.2 TUNEL法检测心肌细胞凋亡

选用10-4mol/L浓度,分别作用不同时间,利用TUNEL法检测细胞凋亡情况,结果表明在NE作用6h时,可见TUNEL阳性细胞,胞核呈不同程度的固缩状态,染成玫瑰红色,在12、24 h,视野中阳性染色细胞数量明显增多,平均每100个细胞中有25士6个阳性细胞。

2.3细胞内钙浓度变化

利用Fura2荧光分光光度法分别测定10-4 mol/L NE干预和空白对照组的心室肌细胞内游离钙离子浓度,结果显示干预组细胞内钙浓度为(318.5士9.3)nmol/L较对照组(285.7±15.6)nmol/L升高了18.2%(P<0.05)。

3、讨论

Ca2+在维持细胞的稳定和正常生理活动中起着非常重要的作用。细胞膜上有很多Ca2+通道来调节细胞内的Ca2+的平衡。TRPM8是一种非选择性阳离子通道,属于TRP蛋白的TRPM亚族。其他两个亚族是TRPC和TRPV家族。TRPM8是ca2+离子通道家族中的一员,在神经细胞中也表达[2],是两种感受冷刺激的温敏TRP通道中的一种,另一种是TRPAI[3]。TRPV亚族的其他一些成员,如TRPVl、V2、V3和V4则能感受热刺激和热化合物[4]。虽然有证据表明TRPM8与感觉神经的热觉和痛觉有关,但是关于TRPM8在其他一些细胞的作用机制还是不很清楚[5]。

钙通道是由αl亚单位和 α2/δ、β、γ几个辅助亚单位构成的复合体,由多基因编码。不同类型的钙通道其α1亚单位的编码基因有所不同,因而其结构也不相同,其中,L型钙通道结构为α1C、α1D、α1S,R和T型钙通道结构为α1E,N型钙通道结构为α1B,P/Q型钙通道结构为α1A。α1亚单位在细胞膜上形成四个跨膜区域(序列I,II,Ⅲ,Ⅳ)。每个跨膜区域由6个α螺旋肽段(S1～S6)及其间的连接肽链组成,其中S5和S6有一部分陷入细胞膜内,形成电压门控离子通道选择性滤孔,称为孔道区。该区表现出强烈的保守性,为通道的核心部分。S4内有规则排列的正电荷残基,为通道的电荷感应部分。α1亚单位决定电压依赖性钙通道的活性和药物的敏感性,也是钙拮抗剂的结合位点。钙通道内各亚基之间有着密切的联系,不同α1亚单位与不同的β亚单位相互作用,可表现出不同的电生理学和药理学特性[6-7]。

人类的TRPM8多肽由1104个氨基酸组成,预测其二级结构中包含6个跨膜结构域和在胞质中的碳端结构域,且S1-S4跨膜结构域呈现出弱的电感受性。通道是由四聚体中的S5和S6间的跨膜序列构成,很可能是四段TRPM8肽段。氨基端包含几个TRPM族的序列,在碳端则包含一个TRP结构(一段TRPV、TRPC、TRPM家族共有的序列)以及8个N糖基化部位。不像其他TRP家族成员,它没有氨基端重复序列。对TRPM8在哺乳动物细胞中的表达研究表明:这种蛋白质可调节膜电位,其中钙钠比为3:l[2-7]。

生命在于运动,但运动又是一把双刃剑,适量的运动有益健康,过量运动损害健康。适量运动又叫有氧运动,也就是说在运动的过程中,增加了氧气的吸入、运输、利用,氧气的吸入量和身体的利用量达到平衡,这样的运动就是适量的。过量运动会导致去甲肾上腺素水平的升高,应激作为心血管疾病的重要病因和诱因已得到确认,有学者甚至认为心血管疾病是第一应激性疾病。已有研究表明,交感一肾上腺髓质系统和下丘脑一垂体一肾上腺皮质轴(HPA)的兴奋在心血管应激反应中起着极其重要的作用,在这过程中,肾上腺素、去甲肾上腺素和糖皮质激素分泌增加,活化心肌细胞膜表面的受体,并通过多种细胞信号传导通路启动生化级联反应,从而介导细胞应激反应乃至应激损伤的发生。然而对于应激损伤的具体发生机制尚存在许多不明之处,尤其对心肌细胞有着重要生理学意义的钙离子通道在其中所发挥的作用还鲜有报道。

本研究模拟应激状态下交感一肾上腺髓质系统兴奋导致的去甲肾上腺素水平的升高,体外给予细胞动作电位时程的延长,而动作电位与心肌正常收缩舒张节律直接相关,长此以往,必将导致心脏的功能障碍,出现心率失常等病变,这可能是应激性心肌损伤的发生机制之一。目前已得到公认,细胞内游离钙浓度的维持是Ca2+跨膜转运和细胞内钙库(肌浆网、线粒体等)摄取、释放钙等过程动态平衡调节所致。这一过程中任一个环节出现异常都可能打破这种平衡,引起钙稳态的失调。本实验发现模拟应激下,心肌细胞内游离钙浓度也出现明显上升,可能正是钙通道电流的增大使细胞钙离子内流增大所致,进而从钙离子通道角度解释了应激导致钙超载发生的机制。

参考文献

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[2]涂知明,Greg Barritt.前列腺癌的分子生物学研究进展[J].中国优生与遗传杂志,2007,15(10):121-123

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[5]Andersson DA,Chase HW,Bevan S.TRPM8 activation by mentho.icilin,and cold is differentially modulated by intracellular pH[J].J Neurosci 2004;24:5364536-5369.

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