热缺血再灌注损伤早期大鼠肝脏基因表达谱的实验研究

材料与方法

1.1实验动物模型的建立

SPF级雄性SpragueDawley（SD）大鼠16只，体重320～380 g，由右江民族医学院动物中心（许可证号：SCXK桂20120003）提供。术前禁食但可适量饮水。称重后采用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，取腹部纵切口，离断镰状韧带及左右三角韧带，分离肝胃韧带，游离门静脉及肝固有动脉。3 min后将门静脉和肝固有动脉阻断30 min，造成原位肝脏热缺血模型，切取标本，即热缺血30 min组。再灌注损伤组为阻断30 min后恢复肝脏血流后30 min、1 h分别切取标本。假手术组仅常规进腹后，游离但不予结扎肝十二指肠韧带内血管，30 min后切取标本。

1.2动物分组与取材

将16只大鼠按热缺血及再灌注的不同时间随机分四组，每组4只。分为：假手术组、热缺血30 min组、再灌注30 min组、再灌注1 h组。四组均在肝脏中叶相同部位取材。全部标本分为2份，1份固定于10%甲醛溶液中，制作石蜡切片，用作病理学观察；另一份切成边长不超过5 mm大小组织块，置于RNALater（德国Qiagen）中4℃保存过夜后，用作基因表達谱芯片分析。

1.3RNA的抽提和体外反转录、表达探针的制备

采用TRIzol试剂盒（美国Life）抽提大鼠肝组织总RNA。样本 RNA浓度检测合格后，按SuperScriptⅡ试剂盒（美国Gibco）说明进行反转录合成cDNA，纯化后的cDNA进行体外转录、RNA Transcript Labeling Kit（美国Affymetrix）标记合成的cRNA探针。

1.4基因芯片和芯片的杂交、洗脱、染色及检测

采用Eukaryotic Hybridization Control Kit（美国Affymetrix）处理cRNA探针，片段化后用于与基因芯片杂交。RAE230A表达谱芯片（美国Affymetrix）含有对应于约16 000个cDNA克隆已知基因原位合成的寡核苷酸群。杂交、洗脱、染色及检测利用“基因芯片系统工作站”专用设备，所有操作均严格按厂家推荐的条件进行。送入高分辨率Genechip Scanner 4000扫描，得到原始图像。

1.5统计学方法

芯片扫描所得数据采用Microarray Suite5.1软件进行读取、处理数据，分析并筛选出再灌注30 min组、再灌注1 h组2种信号强度和比值（Ratio值），基因差异表达强度变化在3倍及以上，即（1）再灌注30 min和再灌注1 h信号比值Ratio>2和Ratio<0.5（P<0.05）的基因；（2）2个重复点信号的重复性>98.5%。

2结果

2.1病理学观察

HE染色结果显示：假手术组肝小叶结构大致正常，无肝细胞变性坏死，再生肝细胞较少（见图1A）。肝脏热缺血30 min组可见典型病理学改变，表现为轻度肝细胞水肿，小叶中央区可见炎症细胞浸润，周围可有再生细胞（见图1B）。而肝脏再灌注30 min和1 h组可见肝细胞结构紊乱，肝窦充血，肝细胞空泡变性、坏死增多，小叶中央静脉瘀血、扩张（见图1C和1D）。再灌注1 h肝脏的损伤较再灌注30 min更为严重。

A：假手术组；B：热缺血30 min组；C：再灌注30 min组；D：再灌注1 h组。

图1各组大鼠肝组织病理改变（HE×200倍）

2.2再灌注30 min和再灌注1 h时的基因表达差异分析

以符合fold change≥3，P<0.05为筛选标准。基因表达谱芯片检测结果显示，大鼠肝脏再灌注30 min表达上调有97条，表达下调46条；再灌注1 h表达上调有182条，表达下调82条；再灌注30 min或1 h表达上调的基因数均多于表达下调基因数，再灌注1 h表达发生变化的基因总数多于再灌注30 min。筛选出大鼠肝脏再灌注30 min、再灌注1 h两组共同差异表达基因有77条，其中表达上调56条，表达下调21条。见表1、表2。

表1大鼠肝脏再灌注30 min和1 h表达上调的部分基因

分类基因缩写基因名称基因序号

细胞周期

Gadd45αgrowth arrest and DNAdamageinducible，alphaNM_024127

物质代谢

Acsl1acylCoA synthetase longchain family member 1NM_012820

Hsd17b2hydroxysteroid（17beta） dehydrogenase 2NM_024391

Fads1fatty acid desaturase 1NM_053445

Pfkfb36phosphofructo2kinase/fructose2，6biphosphatase 3NM_057135

Gfpt2glutaminefructose6phosphate transaminase 2NM_001002819

Pklrpyruvate kinase， liver and RBCNM_012624

Idi1isopentenyldiphosphate delta isomerase 1NM_053539

Hspa1aheat shock 70kD protein 1ANM_031971

Ppp1r15aprotein phosphatase 1，regulatory subunit 15ANM_133546

炎症因子

Cxcl1CXC motif chemokine ligand 1NM_030845

IL10interleukin 10NM_012854

Egr1early growth response 1NM_012551

TGFβ1TGFbeta activated kinase 1/MAP3K7 binding protein 1NM_001109976

HIF1αhypoxia inducible factor 1 alpha subunitNM_024359

氧化应激

Hspa4heat shock protein family A member 4NM_153629

Sirt1sirtuin 1XM_008772947

信号传导

CD14CD14 moleculeNM_021744

细胞凋亡

fosFBJ osteosarcoma oncogeneNM_022197

junJun protooncogene，AP1NM_021835

Bcl2BCL2，apoptosis regulatorNM_016993

JunbJunB protooncogene，AP1 transcription factor subunitNM_021836

表2大鼠肝臟再灌注30 min和1 h表达下调的部分基因

分类基因缩写基因名称基因序号

细胞周期

Ccnd1cyclin D1NM_171992

Cdk2ap2cyclindependent kinase 2 associated protein 2NM_001109498

物质代谢

EhhadhenoylCoA hydratase and 3hydroxyacyl CoA dehydrogenaseNM_133606

Acsm2acylCoA synthetase mediumchain family member 2NM_144748

Gstm5glutathione Stransferase，mu 5NM_172038

Hexbhexosaminidase subunit betaNM_001011946

pdk2pyruvate dehydrogenase kinase 2NM_030872

Ppp3r2protein phosphatase 3，regulatory subunit B，betaNM_021701

Cyp17cytochrome P450，family 17，subfamily a，polypeptide 1NM_012753

炎症因子

Icam1intercellular adhesion molecule 1NM_012967

氧化应激

Sod2superoxide dismutase 2，mitochondrialNM_017051

Hmox1heme oxygenase 1NM_012580

信号传导

Cadm4cell adhesion molecule 4NM_001047107

细胞凋亡

BaxBCL2 associated X，apoptosis regulatorNM_017059

Caspase3caspase 3NM_012922

3讨论

肝脏WIRI是肝脏手术期间肝门血管瞬时缺氧及随后再灌注期间复氧时触发，导致肝细胞损伤。这种损伤主要是再灌注早期复氧后活性氧的急性爆发[5]，其通过多种机制介导肝脏WIRI早期、中期、晚期过程，直接引起组织损伤。活性氧直接影响组织损伤和激活有害细胞级联应答导致炎症、细胞死亡、功能障碍[6]。WIRI涉及整个过程中还通过许多转录因子介导信号途径来调节[7]。因此，肝脏WIRI过程中涉及的基因表达变化对损伤的发生和修复是有研究意义的。

本实验选用高通量、高灵敏性Affymetrix RAE230基因芯片来监测再灌注30 min、1 h各个时间点上基因转录本mRNA的表达，筛选出再灌注早期（30 min、1 h）表达差异的基因，分析再灌注后不同时间点（30 min、1 h）的差异基因（如表1、表2），与文献[8]报道相近似，发现这些显著改变的基因按其参与生物学过程的功能主要涉及细胞周期、能量代谢、损伤修复、炎症因子、核转录因子、趋化因子、信号传导、凋亡与坏死等相关基因，提示WIRI是多基因参与网络调控的复杂过程。

本研究发现再灌注后在30 min与1 h基因表达变化趋势上有不同的结果，再灌注1 h的表达基因数目多于再灌注30 min，但以损伤基因表达增多为主，提示再灌注1 h肝细胞仍继续损伤。再灌注30 min表达基因多为即刻早期基因，而再灌注1 h表达基因多为次级效应基因，其特点反映了再灌注后肝细胞对损伤应答的变化。同时，本实验肝组织病理学观察显示再灌注1 h肝组织损伤程度较再灌注30 min更为严重，也提示了再灌注1 h肝细胞损伤进一步加剧。本研究还发现，再灌注30 min或1 h表达上调的基因数目均远多于表达下调的基因，而表达上调基因多与细胞应激、炎性反应、凋亡及修复基因相关，表达下调基因多与细胞能量代谢相关，说明参与肝脏再灌注损伤早期（30 min、1 h）大量的细胞应激、炎性反应、凋亡及修复相关信号通路被明显活化，而能量代谢及生物合成相关通路受到显著抑制。同时，也提示参与WIRI过程的效应基因及通路随着微环境的变化动态表达。

此外，本研究中再灌注30 min或1 h内，损伤相关基因与修复相关基因表达同时发生改变，提示肝脏组织在热缺血再灌注早期（30 min～1 h）损伤与修复同时存在。我们同期的研究[9]发现再灌注早期超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性下降，表明再灌注早期过量的ROS生成，可下调内源性抗氧化剂SOD的活性而增加氧化应激损伤，予左卡尼汀干预后，则反之。Raza A等[10]发现，诱导谷胱甘肽S转移酶MU转录物5（glutathione Stransferase mu transcripts，GSTM5）过表达有助于氧化应激的减少；而表达增加的脂肪酸合酶可增加氧化应激过程，并促进肿瘤坏死因子α和白介素10介导的细胞凋亡。因此，针对本研究中发现差异表达的损伤相关基因进行干预，可减少热缺血再灌注早期损伤。

总之，我们通过基因芯片技术对热缺血再灌注损伤早期大鼠肝脏基因表达谱的研究，筛选出再灌注30 min、1 h的差异表达基因。一些差异基因参与肝损伤和细胞死亡，而其他基因可能在抗炎、再生和保护机制中发挥关键作用。这些基因为今后研究肝脏WIRI的分子机制提供实验依据，也可为基因干预或治疗提供理论基础。

参考文献

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[3]Quesnelle KM，Bystrom PV，ToledoPereyra LH.Molecular responses to ischemia and reperfusion in the liver[J].Arch Toxicol，2015， 89（5）：651657.

[4]Yang MQ，Ma YY，Tao SF，et al.Mast cell degranulation promotes ischemiareperfusion injury in rat liver[J].J Surg Res，2014，186（1）：170178.

[5]Pantazi E，Bejaoui M，FolchPuy E，et al.Advances in treatment strategies for ischemia reperfusion injury[J].Expert Opin Pharm acother，2016，17（2）：169179.

[6]李文川，浦涧.肝细胞热缺血及再灌注损伤的机制研究现状[J].广西医学，2016，38（2）：233236.

[7]GraciaSancho J，CasillasRamírez A，Peralta C.Molecular pathways in protecting the liver from ischaemia/reperfusion injury：a 2015 update[J].Clin Sci （Lond），2015，129（4）：345362.

[8]Zheng W，Men H，Li J，et al.Global MicroRNA Expression Profiling of Mouse Livers following IschemiaReperfusion Injury at Different Stages[J].PLoS One，2016，11（2）：e0148677.

[9]李文川，高良奎，李浩航，等.左卡尼汀對大鼠肝脏热缺血及再灌注损伤的保护作用[J].右江医学，2016，44（5）：498501.

[10]Raza A，Dikdan G，Desai KK，et al.Global gene expression profiles of ischemic preconditioning in deceased donor liver transplantation[J].Liver Transpl，2010，16（5）：588599.

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