一种提取真菌基因组DNA的新方法

摘 要：真菌基因组高通量测序对DNA纯度和含量要求较高，通过月桂酸钠法、CTAB法和酶裂解法分别提取真菌基因组DNA，然后进行琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 1000测定DNA浓度和纯度，结果证明月桂酸钠法提取的真菌基因组总DNA更适合应用于真菌基因组高通量测序。

关键词：月桂酸钠法 真菌 基因组DNA

真菌为低等真核生物，种类庞大而多样 [1]，在最近的几年里，随着测序技术的不断提高和大片段测序价钱的降低，大量真菌被测序，真菌基因组学研究快速发展。特别是真菌比较基因组学的分析已成为生物进化、系统发生学、药物靶基因、基因发现以及基因功能等方面的研究 [2-3]。而真菌基因组DNA的浓度和纯度直接关系到真菌基因组的测序和组装，从而进一步影响后续的基因注释及分析。高质量和大片段（>30 kb）的真菌基因组DNA可以用于10 kb文库构建和高通量测序。有些真菌由于色素、多糖含量较高，使得传统CTAB方法提取不能获得高纯度、大量的基因组DNA，给后续测序工作带来很大难度。例如，产黄青霉（Penicillium chrysogenum） [4]，该菌产生色素很多，用传统方法很难完全去除色素；对于一些含糖量多的真菌，如冬虫夏草菌（Ophiocordyceps sinensis）中至少含有20种多糖，约占虫草总干质量的3 %～ 8 % [5]，这一类真菌传统方法提取的基因组DNA是达不到高通量测序的要求的。试验采用月桂酸钠法、CTAB法和酶解法分别提取了相同的4株真菌基因组总DNA。这4株真菌都属于Ophiocordyceps sinensis菌株，多糖和色素含量较多。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

Ophiocordyceps sinensis菌株4株，由中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室刘杏忠研究员课题组提供。真菌在铺有玻璃纸的PDA培养基上培养，25 ℃，7～20 d。

1.1.2 仪器

恒温电热水槽，电子分析天平，低温离心机，移液器，NanoDrop 1000，电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统

1.1.3 主要试剂

液氮、1 %月桂酸钠、100 mM NaCl、Tris饱和酚、氯仿-异戊醇（24+1）、异丙醇、70 %乙醇（v/v）、无菌ddH2O、RNase A（Sigma，100 mg/mL）、RNase T1（Fermentas，1000 U/μl，用TE稀释至1000 U/mL）。

1.1.4 溶液配制

1 %月桂酸钠裂解液：100 mM Tris-HCl（pH 8.0），20 mM EDTA，1 % 月桂酸钠，100 mM NaCl，121 ℃灭菌30 min。

TE（pH 8.0）：10 mM Tris-HCl（pH 8.0），1 mM EDTA，1×105 Pa灭菌30 min。

CTAB 裂解液：100 mM Tris-HCl（pH 8.0）、20 mM EDTA（pH 8.0）、1.4 mol / L NaCl。

3M 乙酸钠（pH 5.5）：称取24.61 g乙酸钠，加80 mL ddH2O溶解，用乙酸调节pH至5.5，加ddH2O定容至100 mL，0.22 μm滤膜过滤除菌。

裂解缓冲液：50 mM Tris·HCl（pH 8.0），50 mM EDTA，1 % SDS，10 mM NaCl，1×105 Pa灭菌30 min。

蛋白酶 K（Sigma，10 mg/mL，用无菌ddH2O溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌）。

1.2 真菌基因组总DNA提取方法

1.2.1 月桂酸钠法提取真菌基因组总DNA

用无菌药匙从PDA培养皿中刮取菌丝至无菌研钵中，加液氮用无菌研棒充分研磨至粉末状。在研钵中不断加入液氮，使菌丝在液氮中得到保护，避免基因组DNA降解。研磨时不断连续研钵，当液氮快要挥发完时再次加入，切勿使液氮完全挥发后再加入。提前称量无菌50 mL离心管重，小心将粉末分装至无菌50 mL离心管中（每管不超过2.5 g菌丝粉末），室温放置1～2 min，再称量50 mL离心管重，计算样品粉末重量。将真菌粉末加入预冷离心管，加入1 %月桂酸钠裂解液（按照1 g粉末加入7 mL 月桂酸钠裂解液的比例），用手不断晃动离心管颠倒混匀，15～20 min后，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液（25+24+1），充分颠倒混匀，12000 rpm离心10 min。吸取上清液至一新无菌50 mL离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇（24+1），轻柔颠倒混匀，12000 rpm离心10 min。吸取上清液至一新无菌50 mL离心管中，加入等体积异丙醇（4 ℃预冷），1/10体积乙酸钠。室温下静止5 min。轻微摇晃离心管，可在离心管内用肉眼观察到絮状的DNA沉淀。将离心管朝一个方向水平转动，使絮状DNA沉淀彼此缠绕，最终形成条状。将DNA条状物轻微吸出至干净的15 mL离心管中。加入9 mL 70 %乙醇（4 ℃预冷）洗涤1次，12000 rpm离心5 min。色素多的菌可用70 %乙醇洗涤多次后再离心。小心倒去上清液。将剩余液体尽量吸净并于超净工作台内风干。加入适量（500 μL至1 mL）TE（pH 8.0）或无菌的ddH2O溶解DNA，37 ℃放置1h以充分溶解。通常情况下，RNA并未除尽，可按样品体积加入1/100体积的浓度为10 mg/mL的RNase A（终浓度为100 μg/mL）并在37 ℃处理30 min，除去RNA。防止DNA链断裂，操作要轻柔，不要剧烈晃动，要用剪枪头，添加试剂时要沿管壁缓慢加入，DNA不要反复冻融。

1.2.2 CTAB法提取真菌基因组总DNA

参照Saghai [6]和Guo [7]等的方法，把刮取和称量好的菌丝用液氮在研钵中磨成粉末，中加入65 ℃预热1h；10000 r /min离心10 min。取上清，将上清转移到新的1.5 mL离心管中，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（25+24+1），轻轻颠倒数次，然后12000 r /min离心10 min；重复抽提1次；然后转移上清到新的1.5 mL离心管中，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3 M乙酸钠溶液，轻轻混匀，于-20 ℃放置30 min后12000 rpm离心10 min；除去上清，沉淀可用70 %乙醇洗涤多次后再离心。小心倒去上清，将剩余液体尽量吸净并于超净工作台内风干。加入适量（500 μL至1 mL）TE（pH 8.0）或无菌的ddH2O溶解DNA，37 ℃放置1 h以充分溶解。获得的DNA，-20 ℃ 保存备用。

1.2.3 酶解法提取真菌基因组DNA

提取高通量真菌基因组DNA时对真菌菌丝的前处理不一样，把刮取和称量好的菌丝中加入37 ℃预热的裂解缓冲液（按照1 g粉末加入5 mL lysis buffer的比例），充分混匀，按体积加入1/1000体积的浓度为100 mg/mL的RNase A（终浓度为100 μg/mL）和1/100体积的浓度为1000 U/mL的RNase T1（终浓度为10 U/mL），37 ℃水浴1 h，期间每隔15 min轻柔混匀1次。1 h后，按体积加入1/100体积的浓度为10 mg/mL的蛋白酶K（终浓度为100 μg/mL），55 ℃水浴18～21 h。按体积加入1/10体积的3M 乙酸钠（pH 5.5）和1倍体积的Tris 饱和酚（55 ℃预热），轻柔颠倒混匀10 min。离心操作与CTAB法一致。

1.3 提取获得DNA质量检测

1.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测

真菌基因组DNA提取原液5 μL于1.2 %琼脂糖凝胶电泳，100 V，30 min检测DNA大小，然后用凝胶成像分析系统（Gellabsystem）拍照。

1.3.2 浓度和纯度检测

取1 μL样品用Nanodrop1000检测浓度和纯度，一般认为2.0

2 结果与分析

2.1 琼脂糖凝胶电泳检测基因组总DNA

从电泳结果（图1）可以看出，3种方法提取的基因组总DNA片段大小一致，说明3种方法都可以用于提取基因组DNA。CTAB法提取的基因组DNA条带拖尾弥散，可能是提取过程中DNA发生降解，且部分条带只适合建小片段的库，不能构建大于2 K的库；酶解法提取的基因组DNA条带弱，有些DNA已经降解；月桂酸钠法提取的基因组DNA条带亮、清晰，没有杂蛋白和RNA的污染，说明该法提取真菌基因组DNA效率更高。

2.2 各提取方法获得真菌基因组总DNA的浓度和纯度比较

用Nanodrop1000检测3种方法提取的基因组DNA的浓度和纯度（表1），其中月桂酸钠法提取的真菌基因组DNA得率最高，可达149.0 mg/mL，酶解法次之；月桂酸钠法提取的真菌基因组DNA OD260/OD280比值都接近1.8，说明它们的纯度都较高，蛋白抽提效果都较好。

2.3 不同DNA提取方法耗时比较

针对真菌基因组总DNA的3种提取方法效率比较结果见表2。可见月桂酸钠法具有耗时短的优势，尤其在样品高通量时，优势更突出。

3 讨论

CTAB法来源于植物DNA的提取 [8]，后逐渐应运于真菌菌丝体为材料的 DNA 提取，但由于真菌多糖、多酚等次生物质的存在使提取的真菌 DNA 中总残留多糖杂质，且CTAB是一种阳离子表面活性剂，由于其许多理化性质与核酸很相似，因此很难将它们分开，同时，易于存在多糖的污染，使 DNA 定量不准 [9]。月桂酸钠是一种阴离子表面活性剂，生物降解性很好，不仅有澄清去污作用，还可以促进沉降，月桂酸钠可以很好地洗脱真菌中存在的多糖、色素和多酚等次生物质，使沉降的DNA纯度更高。

与传统方法比较，第一，月桂酸钠法不需要超低温离心，只需要普通离心机和水浴，在一般的微生物实验室就切实可行；第二，月桂酸钠法提取步骤少，提取时间短，提取的过程简单，最大程度地减小了提取过程中DNA的降解，DNA得率高，较为完整，能够获得更加大量而纯度高的DNA样品；第三，月桂酸钠法可以有效将色素、多糖等杂质去除，使得提取的DNA更纯。

同时酶解法提取总DNA需加裂解缓冲液及蛋白酶K过夜，而月桂酸钠法不用，且后者提出的总DNA总量远远多于CTAB法。综合而言，月桂酸钠法是一种提取真菌基因组总DNA 较稳定和高效的方法。

试验首次采用月桂酸钠法，提取到了纯度和浓度都很高的DNA。与传统CTAB法及酶解法真菌基因组DNA提取方法相比，结果显示，月桂酸钠法提取真菌基因组DNA具有明显优势，能够获得高纯度及高浓度的真菌基因组DNA，本方法将为真菌基因组测序前期制备大片段文库提供高质量的基因组DNA。这种新的提取真菌基因组DNA的方法还同样适用于细菌和植物基因组DNA的提取。

参考文献

[1] Kirk P.M.，Cannon P.F.，David J.C.，Stalpera J.A.，Dictionary of the fungi. 9thed. CAB International，Wallingford，UK. 2001，1-655.

[2] Hsiang T.，Baillie D.L. Issues in comparative fungal genomics[J]. Applied Mycology and Biotechnology，Bioinformatics Issue. 2006（6）：100-122.

[3] Xu J.R.，Peng Y.L.，Dickman M.B.，Sharon A. The dawn of fungal pathogen genomics[J]. Annual Review of Phytopathology. 2006（44）：337-366.

[4] Berg M.A.，Albang R.，Albermann K.，et al. Genome sequencing and analysis of the filamentous fungus Penicillium chrysogenum[J]. Nature Biotechnology，2008，26（10）：1161-1168.

[5] 苏颖，周选围. 改进苯酚-硫酸法快速测定虫草多糖含量[J]. 食品研究与开发，2008，29（3）：118-121.

[6] Guo L.D.，Hyde K.D.，Liew E.C.Y. Identification of endophytic fungi from Livistona chinensis based on morphology and Rdna sequences[J]. New Phytologist，2000，147：617-630.

[7] Saghai M.A.，Solman K.M.，Jorgensen R.A.，et al. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley：Mendelian inheritance， chromosomal location and population dynamics[J]. PNAS，1984，81（24）：8014-8018.

[8] 陈昆松，李 方，徐昌杰. 改良CTAB法用于多年生植物组织基因组DNA的大量提取[J]. 遗传，2004，26（4）：529-531.

[9] 吴志红，汪天虹，黄 卫. 简便易行的丝状真菌染色体 DNA 提取法[J]. 菌物系统，2001，20（4）：57-58.

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