花生根际解磷真菌的分离及其解磷能力研究

摘要 [目的]分离花生根际解磷真菌及测定其解磷能力。[方法]利用土壤稀释平板法，从花生根际土壤中分离筛选出解磷真菌PFK-2，接种于以Ca3（PO4）2为唯一磷源的液体培养基，振荡培养24、48、72、96、120、144、168 h时测定培养液的pH值、速效磷含量、菌丝混合物重。[结果]随着培养时间的增加，培养液pH值先降低后升高，菌株的溶磷量先增加后降低，菌丝混合物重量增加，当培养时间为120 h时，培养液pH值最低，速效磷含量最大。培养液pH值与菌丝重、菌株的溶磷量均呈极显著负相关（P<0.01）。[结论]在振荡培养120 h时，溶磷真菌PFK-2的解磷效果最佳。

关键词 解磷真菌；速效磷含量；花生根际

中图分类号 S182 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）18-0206-02

Study on Screening Phosphate-solubilizing Fungi from Peanut Rhizosphere Soil and Its Phosphate Solubilization Capacity

XU Wen-feng 1，2 XU Chun-ying 1，2 HU Zhao-ping 1，3 LI Xin-zhu 1，3

（1 Kingenta Ecological Engineering Group Co.，Ltd.，Linshu Shandong 276700； 2 Key Laboratory of Plant and New Fertilizer R&D，Ministry of Agriculture，P.R.China； 3 National Engineering Technology Research Center For SCRF）

Abstract [Objective]Fungi，capable of dissolving phosphorus was isolated from peanut rhizosphere soil.[Method] The Fungi PFK-2 was screened from peanut rhizosphere soil，and Ca3（PO4）2 as the only P source of liquid culture medium were adopted to inoculate Fungi PFK-2，the pH value，available phosphorus content，weight of mycelium of culture medium and the P content absorbed by fungi were measured in shaking culture for 24，48，72，96，120，144 and 168 h.[Result]With the extending of culture time and the pH of culture medium was dropped firstly and then increased，the P solubilization capacity of strains raised firstly and then decrease，weight of mycelium increased，when the culture time was120 h，the pH of culture medium was the lowest，weight of mycelium the highest and the content of available phosphorus the largest.The pH of culture medium all had extremely significant negative correlation with the weight of mycelium and P solubilization capacity of strains（P<0.01）.The P-dissolving ability of inorganic P by Fungi PFK-2 was better than the one of organic P.[Conclusion]The phosphate-dissolving effect of Fungi PFK-2 was the best when shaking culture was for 120 h.

Key words phosphate-solubilizing fungi；available phosphorus content；peanut rhizosphere soil

磷肥作为植物所需的大量营养元素之一，施用磷肥可以增加土壤中有效磷的含量，但磷与土壤中有机质、Ca2+、Fe3+、Al3+结合会形成难溶性的无机态或有机态磷，从而丧失有效性[1]。土壤中的微生物是土壤肥力的核心，其不仅数量巨大，且种类极多，部分种类对土壤氮、磷和钾等养分的转化和供给起到非常重要的作用。因此，对土壤中解钾菌、解磷菌和固氮菌的研究已经得到人们的重视[2]。解磷微生物能够依靠自身的代谢产物或与其他生物协同溶解土壤中的难溶无机磷转化为可利用状态[3]，并通过影响植物根系分泌物的种类和数量来增加植物根系对周围 K、Ca、Mg、Fe、Zn等营养元素的吸收，满足作物生长的需要，从而促进植物生长发育，提高产量。

解磷微生物的相关研究国内外多有报道，包括细菌、真菌和放线菌等[4]，其中溶磷细菌的数量种类较多，解磷真菌在数量上远不如解磷细菌多，其种类也少，但解磷真菌的溶磷能力比解磷细菌强几倍或10倍以上，并且许多细菌在进一步的纯化过程中容易失去解磷能力，而真菌则可以始终保持其解磷活力；解磷真菌主要有青霉（Penicillium）、曲霉（Aspergillus）、根霉（Rhizopus）、镰刀菌（Fusarium）、小丝核菌（Sclerotium）等，目前研究报道较多的是黑曲霉和青霉[5-6]。

试验中从花生根际土壤分离溶磷真菌，通过溶磷透明圈试验筛选出解磷真菌PFK-2，然后检测无机磷液体培养过程中菌液的pH值、生物量、溶磷量，以探讨所选青霉菌株的溶磷特性，为以后制成相应的微生物菌剂进行大田试验应用研究提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试土壤。土壤来自临沭县农田，采自花生根际0～10 cm土壤，土壤类型为棕壤，质地为砂壤，pH值5.24，含有机碳1.10%、全氮799.86 mg/kg、速效磷48.35 mg/kg、可溶性钾69.44 mg/kg，土壤样品带回实验室，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.1.2 培养基。①马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，水1 000 mL，自然pH。②马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，自然pH。③无机磷固体培养基[7]：葡萄糖10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·H2O 0.03 g，Ca3（PO4）2 5.0 g，琼脂 20 g，定容至1000 mL，pH值7.0～ 7.5。用于解磷真菌的分离及培养。④无机磷液体培养基[7]：葡萄糖10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，Ca3（PO4）2 5.0 g，定容至 1 000 mL，pH值7.0～7.5。用于解磷真菌解磷能力的测定。

1.1.3 主要仪器设备。紫外可见分光光度计、生化培养箱、立式电热蒸汽压力灭菌锅、烘箱、空气浴培养摇床、超净工作台、电子天平。

1.2 试验方法

1.2.1 解磷真菌的分离。称取土壤样品10 g于90 mL无菌水的三角瓶中，将三角瓶置于摇床上120 r/min，振荡30 min，使土壤颗粒均匀分散于蒸馏水中，得到稀释倍数为10的土壤悬浮液；取 1 mL上清液作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释，各吸取300 μL均匀涂布于平板培养基上，每个浓度重复 3皿，30 ℃ 条件下培养 48 h后，取出观察平板长成的菌落，菌落周围出现透明圈的则表明该菌落中存在具有解磷能力的菌体。再将此菌落中所有可能的菌体转接并继续培养观察，通过如此反复分离筛选，最终根据产生透明圈的大小确定具有较高解磷能力的真菌作进一步研究[8] 。

1.2.2 固体培养条件下溶磷能力测定。将分离筛选得到的解磷真菌接于无机磷固体平板上，3次重复，28 ℃恒温倒置培养7 d，测定菌落的直径（d）、溶磷圈的直径（D）、解磷圈直径与菌落直径的比值（D/d），以无解磷能力的对照菌株作为参照。

1.2.3 液体培养条件下解磷能力。将筛选得到的解磷真菌接种到PDA平板上，待菌落长满平板后，用直径0.6 cm打孔器取一片菌块接种到装有200 mL无机磷液体培养基的500 mL三角瓶中，28 ℃，120 r/min 振荡培养。分别在24、48、72、96、120、144、168 h时取出过滤去除菌丝，用钼蓝比色法测定滤液在OD700的吸光值，通过有效磷含量标准曲线来计算溶液中的有效磷含量[9]，以确定菌株对Ca3（PO4）2的溶磷能力。

1.2.4 pH值的测定。分别在振荡培养24、48 、72、96、120、144、168 h时取出三角瓶，过滤去除菌丝，用pH计测定滤液pH值。

1.2.5 菌丝体重量的测定。在振荡培养24、48 、72、96、120、144、168 h时取样，过滤获得菌丝体混合物，用蒸馏水洗净，置于烘箱80 ℃烘8 h，利用干重法得到解磷真菌菌丝的重量[10-11]。

2 结果与分析

2.1 溶磷真菌的分离筛选

溶磷菌相对溶磷能力的指标之一是溶磷圈的大小，可以表征其分解无机磷能力的强弱，一般溶磷圈大，说明溶磷能力较好，反之，则较小[12]。根据溶磷圈大小，经过反复筛选试验，最后得到一株解磷能力较好的真菌菌株，编号为PFK-2，对该菌株进行解磷能力测定。

2.2 难溶无机磷固体培养条件下PFK-2溶磷能力

将筛选出的编号为PFK-2的菌株在无机磷固体培养基平板上倒置培养7 d后，形成肉眼可见的透明溶磷圈，具体如图1所示。其菌落直径（d）4.9 cm，溶磷圈直径（D）7.4 cm，D/d=1.51，表明该溶磷真菌在难溶性无机磷固体培养基上生长良好，其溶磷能力较好。

2.3 不同培养时间溶磷真菌PFK-2溶磷量和pH值变化

由图2可知，在无机磷培养基摇床培养时，随着培养时间的延长，pH值先降低后有所升高并趋于稳定，溶液速效磷含量先缓慢增加后降低并趋于稳定。培养24 h后变化都不大，至培养48 h时，溶液速效磷含量达到158.96 mg/L，pH值降低为4.53后，开始出现明显变化，pH值明显降低，速效磷含量快速升高，直到培养120 h时，pH值降至最低为2.3，此时速效磷含量达到最高，为840.27 mg/L。

有关溶磷微生物溶磷量与培养介质pH值的关系，试验研究有不同的结论。赵小蓉[12]和Narsian等[13]研究得出，溶磷菌的溶磷量与培养介质pH值之间没有显著相关性，而王莉晶等[14]研究得出解磷菌C2解磷过程中，代谢产生大量有机酸，随着pH值下降其解磷能力提高，并证明了解磷菌C2的溶磷量与培养介质pH值之间存在相关性[15]。该试验中，培养介质pH值与溶磷菌PFK-2溶磷量呈线性负相关，其线性方程为y=-183.88x+1 191.7（r=0.928 6，r0.05=0.632，r0.01=0.765），达极显著负相关，这说明试验中溶磷真菌PFK-2的解磷能力可能是菌株在生长过程中代谢产生了酸性物质[16]，降低了培养介质的pH值，增加了难溶性磷酸盐的溶解量。

2.4 不同培养时间无机磷液体培养基pH值和菌丝生物量变化

由图3可知，接入解磷真菌PFK-2 24 h后，pH值迅速降低至5.7，以后缓慢降低，在培养第120 h时降低至最低为2.3，随后有所升高，最终达到2.48；菌丝中从开始缓慢增加，最后有所升高，可能是因为培养时间过长，液体培养基营养物质缺乏；pH值与菌丝生物量呈线性负相关，其线性方程为y=-0.187 6x+1.544 7（r=0.954 8，r0.05=0.632，r0.01=0.765），达极显著负相关。

2.5 不同培养时间溶磷菌PFK-2溶磷量与菌丝生物量变化

由图4可知，随着培养时间的增加，菌丝生物量不断增加，至培养120 h时，达到最重为1.14 g，之后稍微降低；而培养液中可溶性磷含量随着培养时间的增加不断提高，至培（下转第216页）

养120 h时，达到最高为840.27 mg/L，之后有所降低。对菌丝生物量与溶磷量进行线性关系分析，得到线性方程为y=836.7x-205.16，相关系数为r=0.830 2（r0.05=0.632，r0.01=0.765），为极显著正相关，说明菌丝生物量与溶磷菌溶磷量具有良好的相关性。这与康贻军等研究的溶磷量与培养液菌体的生物量存在极显著正相关性这一结论一致，结合2.4中菌丝生物量与培养介质pH值的相关性，可以说明生物量的累积能够增加培养介质中有机酸的量，进而降低培养介质pH值，从而增加了难溶性磷酸盐的溶解量[17]。

3 结论与讨论

从花生根际土壤分离筛选出1株对Ca3（PO4）2具有较好溶磷能力的真菌PFK-2，在固体无机磷培养基上培养时，D/d值为1.51；液体无机磷条件下培养至120 h时释放的有效磷含量最高为840.27 mg/L，说明菌株PFK-2具有较好的溶磷能力。在振荡培养144 h内，pH值降低，速效磷含量增加，菌丝生物量增加；根据菌株PFK-2溶磷曲线、pH值变化曲线等，可以得出在振荡培养120 h时，其解磷效果最佳。

多种研究表明，解磷菌的解磷机制是多样性的。一般认为真菌的解磷能力与其产生的有机酸有关，这些有机酸能够降低pH值，与铁、铝、钙、镁等离子结合，从而使难溶性磷酸盐溶解。王莉晶等[14]发现，P.oxalicum在代谢过程中产生苹果酸和酒石酸。Ahuja等[16]认为，Paecilomyces marquandii AA1产生的柠檬酸和草酸是导致解磷的重要条件。Cunnin-gham[17]认为，P.bilaii产生的草酸和柠檬酸是溶解磷酸钙的主要机制。该试验通过对溶磷真菌PFK-2解磷能力研究发现，培养时间对真菌的解磷能力有显著影响，其溶磷量随培养时间的增加而增加，呈显著正相关性；溶磷量与培养液pH值及菌体生物量分别呈极显著的负、正相关性。由此表明，PFK-2菌株解磷能力的高低与酸性物质的产生有密切关系，在培养过程中，供试菌株PFK-2的生物量决定了培养液中有机酸的含量，进而决定了培养液pH值的大小，最终决定了难溶性磷酸盐的溶磷量。对于解磷真菌PFK-2具体解磷机理还有待进一步探究。

对于日后施肥措施，可以将解磷真菌PFK-2液体培养120 h后，与固体发酵后得到孢子粉及腐熟有机肥进行复配，做成微生物菌肥用于大田试验。

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