TOLL样受体3在大鼠心肌缺血/再灌注损伤中的作用机制

材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 TLR3基因敲除大鼠[许可证号SCXM（赣）2014-0012]30只，8周龄，雌雄各半，由北京大学医学部实验动物科学部提供。野生型SD大鼠30只，由南昌大学实验动物中心提供。本研究已经通过南昌大学医学院动物伦理委员会审查。

1.1.2试剂 肌酸激酶同工酶（CK-MB）监测试剂盒（武汉亚法生物制品有限公司）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA），兔抗小鼠辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国Sigma公司，小鼠抗Akt单克隆抗体、TLR3抗体、NF-κB抗体购自美国Santa Cruz公司，蛋白浓度测定标准品购自普利莱公司。

1.2方法

实验动物分为4组，分别为假手术组（野生型）（n=15）、缺血/再灌注组（野生型）（n=15）、假手术组（TLR3-/-）（n=15）及缺血/再灌注组（TLR3-/-）（n=15）。制作大鼠缺血/再灌注模型，实验前禁食12 h，10%水合氯醛麻醉（3.5 ml/kg）大鼠，仰卧位固定，气管插管，接人工呼吸机（呼吸频率：70 次/min，潮气量：20 ml，呼吸时比1∶1）。开胸结扎冠脉左前降支，胸骨左侧2 mm切开皮肤，钝性分离肌肉见肋骨，在三四肋间，用拉钩拉开胸壁，小心剪开心包膜，在左心耳下缘3～4 mm进针，进针深约1.5 mm，斜向右上方肺动脉圆锥方向进针，针距约3～4 mm。稳定1 min后，收紧结扎线，30 min后轻拉松结线，扩开血管再灌注，缝合[4]。假手术组仅分离前室间支，不结扎[4]。假手术组（野生型）丝线穿过冠状动脉但左室支但不结扎，通过尾静脉注射生理盐水；缺血/再灌注组（野生型）制作大鼠缺血/再灌注模型；假手术组（TLR3-/-）丝线穿过冠状动脉但左室支但不结扎，通过尾静脉注射生理盐水；缺血/再灌注组（TLR3-/-）选取TLR3基因敲除大鼠制作大鼠缺血/再灌注模型。

1.3指标观测

1.3.1生化指标的检测 各试验组大鼠缺血/再灌注2 h后，从腹主动脉采血5 ml，静置30 min，离心10 min（4℃，3000 r/min），进行血清分离，按照试剂盒说明测定MDA、GSH、CK-MB含量。

1.3.2大鼠左心室收缩期末期容积、舒张末期容积、射血分数的测定 实验大鼠经过冠脉套扎术后8周，通过超声心动图测左心室收缩末期容积（LVESV）、左心室舒张末期容积（LVEDV）、左心室射血分数（LVEF）。选取异氟烷进行轻度全麻，使用12 MHz探头，从胸骨旁长轴短轴和四个腔室定位获得二维心室图，通过Modified Simpson Rule测量LVESV及LVEDV，LVEF=（LVEDV-LVESV）/LVEDV×100%，同一观察对象采用双盲法测量所有测量值，所有测量结果连续测5次取平均值。

1.3.3 Western blot法检测TLR3、NF-κB蛋白表达 制模结束后处死手术处理后的存活大鼠，按试剂盒说明书步骤提取总蛋白，碾磨心肌组织，BCA法蛋白进行蛋白定量，SDS-PAGE分离样品后转膜，常温下TBST封闭过夜，加入一抗后室温下免疫沉淀1 h，再加入兔抗小鼠辣根过氧化物酶标记的二抗2 h，显影，定影，扫描。

1.4统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1四组大鼠MDA、GSH 、CK-MB水平的比较

缺血/再灌注组（TLR3-/-）的MDA、CK-MB含量低于缺血/再灌注组（野生型），GSH含量高于缺血/再灌注组（野生型），差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

2.2四组大鼠LVESV、LVEDV、LVEF的比较

缺血/再灌注组（TLR3-/-）组的LVEDV、LVESV低于缺血/再灌注组（野生型），LVEF高于缺血/再灌注组（野生型），差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

2.3四组大鼠心肌组织TLR3、NF-κB蛋白表达的比较

缺血/再灌注组（野生型）TLR3、NF-κB蛋白表达均高于假手术组（野生型），差异有统计学意义（P<0.05）。缺血/再灌注组（TLR3-/-）的TLR3蛋白及NF-κB表达低于缺血/再灌注组（野生型），差异有统计学意义（P<0.05）（表3）。

3讨论

心肌缺血/再灌注损伤常发生于急性心肌梗塞溶栓术、体外循环心内直视手术及冠脉内球囊扩张血管成形术等过程中。其机理复杂，目前认为与再灌注后氧自由基大量生成、细胞内钙超载、微血管内皮细胞损伤及血管内皮细胞与血小板聚集粘附有关。改善缺血区心肌细胞正常功能，是目前心肌缺血/再灌注研究的重要方面[5-7]。

Toll样受体家族蛋白分为细胞外区和细胞内区，内区与白细胞介素-1受体结构相似的信号传导结构域组成，能识别侵入体内异物，不仅激活固有免疫应答，还可以激活适应性免疫应答，启动下游的信号通路，通过募集中性粒细胞、吞噬细胞诱导炎症反应，释放大量的炎症因子（如各种白介素因子）介导炎症的产生[8-12]。人类TLR3由904个氨基酸组成，其相对分子量约为125 KU，可以识别病毒来源的双链RNA，激活NF-κB及干扰素调节因子，引起炎性细胞因子的释放。近年有研究发现，TLR3在人动脉粥样硬化组织起源的平滑肌细胞上的表达上调，可引起许多趋化因子和炎性细胞因子表达增加，这些因子均具有促动脉粥样硬化作用。

本实验通过TLR3基因敲除大鼠及野生型大鼠制作缺血/再灌注模型。缺血/再灌注组（TLR3-/-）反映氧化损伤的MDA含量低于缺血/再灌注组（野生型），反映心肌细胞缺血受损的CK-MB含量降低，GSH含量升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。缺血/再灌注组（TLR3-/-）的LVEDV、LVESV低于缺血/再灌注组（野生型），LVEF高于缺血/再灌注组（野生型），差异有统计学意义（P<0.05）。提示TLR3基因敲除后，可以延缓心室重构，改善心功能。实验结果提示缺血/再灌注可以刺激TLR3表达，进一步激活NF-κB，引起心肌炎症反应，加重缺血/再灌注损伤，而在TLR3基因敲除组大鼠，可以通过减少TLR3蛋白及NF-κB表达减轻炎症反应，对缺血/再灌注心肌起到保护作用。同时有研究发现TLR3可诱导血管活性氧产生增加，可引起血管舒张功能受损、再内皮化减少加剧，内皮细胞功能受损[13-15]。

综上所述，TLR3在心肌缺血/再灌注的发展过程中起着保护作用，但其确切的机制尚未完全明确，需要进一步明确，为治疗心肌缺血/再灌注损伤提供新的治疗靶点。

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（收稿日期：2017-08-30 本文编辑：孟庆卿）

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