HSP90—eNOS在糖尿病大鼠胸主动脉的表达及普罗布考干预实验

摘要：目的 建立糖尿病大血管病變模型，觀察HSP90和eNOS在糖尿病大鼠胸主动脉中的表达，以及普罗布考干预治疗后的影响。方法 50只雄性SD大鼠分为正常对照组（N组）和模型组，模型组以高糖高脂喂养联合腹腔注射STZ成模。以随机血糖≥16.7 mmol/L并维持2 w者定为造模成功。成模大鼠随机分为糖尿病组（DM组）和普罗布考干预组（PB组），PB组每日以普罗布考灌胃，N组和DM组以等体积柠檬酸钠缓冲液灌胃。8 w后处死大鼠并分离胸主动脉，光镜下观察胸主动脉病变，免疫组织化学检测血管组织HSP90、eNOS的表达。结果 ①DM组大鼠胸主动脉内皮细胞广泛脱落，平滑肌排列紊乱。PB组大鼠胸主动脉可见内皮细胞灶状脱落，平滑肌排列稍紊乱。N组大鼠内皮细胞光滑平整，平滑肌排列整齐。②DM组大鼠较N组大鼠相比，胸主动脉表达HSP90明显升高（P<0.05）。PB组与DM组比较，胸主动脉HSP90表达无明显差异（P>0.05）。三组间胸主动脉表达eNOS无明显差异（P>0.05）。结论 ①高糖高脂喂养联合腹腔注射STZ的糖尿病大鼠，胸主动脉呈早期动脉粥样硬化改变；②HSP90在糖尿病大鼠胸主动脉表达明显升高，普罗布考干预治疗后对其表达无明显影响。

关键词：HSP90；ENOS；糖尿病鼠；糖尿病大血管病；普罗布考

Expression of HSP90-eNOS in Thoracic Aorta of Diabetic Rats and Probucol Intervention

HUANG De-bin，ZHAI Xin，LI Xiao-xing

（Department of Endocrinology and Metabolism，Third Hospital of Changsha City，Changsha 410015，Hunan，China）

Abstract：Objective To establish diabetic model，observe the expression of HSP90 and eNOS in thoracic aorta in diabetic rats，and the effects of probucol treatment.Methods 50 male SD rats were divided into normal control group（N group）and model group，model group with high fat and high sugar feeding combined with intraperitoneal injection of STZ model.With random blood glucose≥16.7 mmol/L and maintained for 2 w as animal model.The rats were randomly divided into diabetic group（DM group）and probucol group（PB group），PB group daily with probucol gavage，N group and DM group with equal volume of citric acid sodium buffer intragastric.8 w rats were killed after separation and thoracic aorta，thoracic aortic lesions observed under light microscope，detection of vascular tissue by immunohistochemistry.The rats were sacrificed 8 w after separation and thoracic aorta，thoracic aortic lesions observed under light microscope，immunohistochemical detection of vascular tissue HSP90，eNOS expression. Results ①thoracic aorta endothelial cells in DM group rats off，smooth muscle derangement thoracic aorta of.PB rats showed focal loss of endothelial cells，smooth muscle cells arranged a little disorder of endothelial cells of rats in.N group is smooth，smooth muscle cells arranged in neat rows②the rats in the DM group than in N group rats compared to the expression of HSP90 in thoracic aorta（P<0.05）increased significantly in.PB group compared with DM group，the expression of HSP90 in thoracic aorta（P>0.05）.No significant difference between the three groups had no significant difference in eNOS expression in the aorta of diabetic rats（P>0.05）.Conclusion ①the high-fat feeding combined with intraperitoneal injection of STZ，thoracic aorta showed early atherosclerotic changes；②the expression of HSP90 in the chest the aorta of diabetic rats increased significantly，probucol treatment had no obvious effect on its expression.

Key words：HSP90；ENOS；Diabetic rats；Diabetic macrovascular disease；Probucol

糖尿病大血管病变占糖尿病患者致死原因的75%，其突出的特点是加速的动脉粥样硬化。近年研究发现热休克蛋白90（heat shock protein 90，Hsp90）作为蛋白折叠的辅助因子，介导内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）活性，调节NO和超氧化物的产生，对血管内皮起重要作用。糖尿病高血糖状态下，HSP90和eNOS是否介导了糖尿病大血管病变的发生机制，目前无相关报道。

普罗布考是一种调脂药，临床应用广泛，其抗动脉粥样硬化的作用近年被较多关注。普罗布考抗动脉粥样硬化的作用是否有HSP90介导，目前尚不清楚。本实验建立糖尿病大鼠模型，诱导大血管病变发生，观察糖尿病大鼠胸主动脉HSP90、eNOS表达的变化及普罗布考干预治疗对糖尿病大鼠胸主动脉HSP90、eNOS表达的影响，实验旨在进一步为糖尿病大血管病變及普罗布考抗动脉粥样硬化提供理论依据。

1 资料与方法

1.1实验动物 健康8周龄SD雄性幼鼠50只，体重180～250g。由长沙市东创实验动物科技公司提供[SCXK（湘）2009-0012]。

1.2动物分组及处理 SD大鼠随机分为正常对照组（N组，n=10）和模型组（n=40）。模型组予高糖高脂饲料喂养联合腹腔注射STZ（30 mg/kg）造模，72h后测随机血糖≥16.7 mmol/L并维持2 w为模型成功。对照组予以普通饲料喂养并等量柠檬酸钠缓冲液腹腔注射。共30只大鼠造模成功。

将造模成功的大鼠随机分为糖尿病组（DM组，n=15）和普罗布考组（PB组，n=15）。喂养8周高糖高脂饲料，PB组每天以普罗布考500 mg/（d·kg）灌胃，N组和DM组以等容量羧甲基纤维素钠溶液灌胃。至全部实验结束，N组、DM组、PB组有效大鼠数分别为7、8、7只。

1.3标本采集 至实验结束，全部大鼠禁食不禁水12 h，眼眶静脉取血，离心分离血清，检测血糖。取血后以水合氯醛腹腔注射麻醉，分离胸主动脉，-80℃冰箱保存。第2 d胸主动脉经常规固定、脱水、透明、浸蜡、包埋等步骤制成蜡块。

1.4指标观察和检测

1.4.1血清血糖检测 血糖采用强生稳步倍加型血糖仪测定。

1.4.2主动脉病理组织学观察 取胸主动脉，HE染色光镜下观察血管的病理情况。

1.4.3 HSP90和eNOS在胸主动脉壁的表达 应用免疫组织化学染色原理进行，具体操作参照试剂盒说明。结果判定：阳性信号为胞浆内出现染色为黄色或棕黄色颗粒。采用Motic Fluo 1.0 图像分析系统对染色结果进行分析：高倍镜下（×400）每张切片随机选取5个互不重复的视野，获得每个图像的积分光密度（integal optieal density，IOD）和總染色阳性面积（SUM）。蛋白表达量越大，染色越深，IOD值越大。每个图像的IOD值乘以阳性染色面积即为总染色阳性面积。二者结合判断目的蛋白的实际表达和分布。

1.5统计学分析 采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据经正态分布检验后用均数±标准差（x±s）表示，两样本均数的比较用t检验，多样本均数比较用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1各组干预8 w后血糖比较 PB组、DM组较N组相比，血糖升高。PB组和DM组相比，血糖无明显差别。

2.2胸主动脉HE染色 胸主动脉HE染色显示，DM组大鼠胸主动脉内皮细胞广泛脱落，平滑肌细胞增生，排列紊乱，可见少量淋巴细胞浸润，未见泡沫细胞及斑块形成。PB组可见内皮细胞灶状脱落，平滑肌细胞排列稍紊乱。N组内皮细胞光滑平整，平滑肌细胞排列整齐。

2.3胸主动脉HSP90免疫组化 免疫组织化学检测显示，HSP90在动脉内皮细胞及平滑肌细胞均有表达，且DM组和PB组明显高于N组，见图2。Motic Fluo 1.0 图像分析系统对染色结果分析，总染色阳性面积结果显示：N组、DM组、PB组三组总阳性染色面积分别为（23.97±8.41）μm2、（58.38±8.41）μm2、（50.47±7.36）μm2，DM组和PB组与N组比较均明显增高（P<0.001），而DM组和PB组之间无统计学差异（P>0.05）。提示HSP90在糖尿病大鼠胸主动脉中表达明显升高，PB治疗对胸主动脉的HSP90的表达无明显影响。

2.4胸主动脉eNOS免疫组化 免疫组织化学检测显示，eNOS仅在动脉内皮细胞表达，平滑肌细胞无表达，各组之间eNOS的表达无明显差别，见图3。Motic Fluo 1.0 图像分析系统对染色结果分析，N组、DM组、PB组三组总阳性染色面积分别为（2.74±0.71）μm2、（3.50±0.71）μm2、（2.65±0.83）μm2，总染色阳性面积显示各组无统计学差异（P>0.05）。

3 讨论

本实验采用高糖高脂饲料喂养联合腹腔注射STZ方法制造糖尿病动物模型并检测胸主动脉粥样硬化程度，观察到糖尿病组大鼠胸主动脉呈早期动脉粥样硬化改变；糖尿病组大鼠较N组大鼠相比，胸主动脉表达HSP90明显升高；普罗布考治疗组与糖尿病组比较，胸主动脉HSP90表达无明显差异；三组间胸主动脉表达eNOS无明显差异。

实验采用高糖高脂饮食联合STZ腹腔注射建立糖尿病大血管病变的大鼠模型，其机制是：①高糖高脂饮食促进胰岛β细胞凋亡，加重胰岛素抵抗，加速动脉粥样硬化，对血管形成“糖脂毒性”，符合目前糖尿病大血管病变的致病学说。②STZ腹腔注射打击胰腺功能，并继续喂以高糖高脂饲料致胰腺失代偿分泌，最后诱发高血糖症，符合人类糖尿病的演变进程。但本实验制造的糖尿病大血管模型仅表现为早期动脉粥样硬化，没有出现典型的主动脉内膜下大量泡沫细胞聚集，中膜增生的变化，考虑与下列因素有关：①鼠类为抗血管病变动物，虽易出现血脂增高及外周胰岛素抵抗，但不易形成动脉粥样病变。②喂养时间不够。糖尿病大血管病变的形成是一个比较漫长的过程，如在人类一般需要经历5～10年的高血糖时期，才能形成较明显的大血管病变。但对动物，若是过度延长观察时间，动物死亡率也将明显增高，因此改进造模的方法可能提高实验的效率。有报道，在上述方法的基础上饲料中添加胆酸钠及甲巯咪唑和配合维生素D3灌胃的方法能显著提高糖尿病大血管病变大鼠的成模率[1]。

Hsp90是与应激保护密切相关的一类分子蛋白，研究发现它在心血管疾病的发生、发展和血流动力障碍中也起到重要的作用[2]。HSP90的作用主要是通过调节eNOS活性而实现，eNOS产生NO可以保护内皮功能，若产生超氧化物则损伤内皮功能。氧化应激是高血糖引起组织损伤的共同基础[3]，参与了微血管和大血管并发症的发生、发展。本实验观察到糖尿病组大鼠胸主动脉HSP90表达明显升高，可能原因为：应激情况下，机体为了抵抗损伤带来的不可逆性伤害，内皮细胞HSP90分泌水平代偿性增高。但这一代偿因素在动物整体情况下并没有多大积极意义，因为高糖也影响HSP90-eNOS的结合和eNOS的磷酸化，导致HSP90和eNOS解偶聯，产生大量的活性氧自由基，提高了氧化应激水平，加速了大血管病变的发生和发展[4-5]。本实验同时检测的eNOS蛋白总量在糖尿病和正常大鼠中未存有差异，可能与本实验所采用的eNOS抗体类型有关。实验是针对所有eNOS蛋白的抗体，包括聚合型和解离型，而高糖情况下，仅是聚合型eNOS的比例减少，而总eNOS的量并无变化。因此，若能分别采用针对聚合型和解离型的差异性蛋白抗体，有望得出eNOS在糖尿病与正常大鼠组间存在显著性差异。

本实验还发现，经普罗布考干预治疗后，糖尿病大鼠胸主动脉内HSP90的表达无明显改变，提示普罗布考可能不影响HSP90与eNOS的相互作用途径。普罗布考抗氧化作用主要来自氧离子捕捉和断链抗氧化的特性，而HSP90参与eNOS活性调节可能是通过影响小窝蛋白（caveolin-1）、酶的活化、成熟和转移及接下来的蛋白激酶（Akt）的活性、Serine的磷酸化[6]，二者作用途径之间可能没有必然的共同通路。另外，实验动物例数较少可能也是结果阴性的原因所在。

综上所述，糖尿病大鼠胸主动脉HSP90的表达水平明显增高，提示HSP90可能参与糖尿病大血管病变的发生机制，但其具体的分子机制仍有待进一步探索。

参考文献：

[1]靳瑾，孙侃，薛以贵，等.实验性糖尿病大血管病变SD大鼠模型的建立[J].石河子大学学报（自然科学版），2009（5）：622-625.

[2]Lindquist S L.HSP90 and the chaperoning of cancer[J].Nature Reviews Cancer，2005，5（10）：761-72.

[3]Brownlee M.The pathobiology of diabetic complications：a unifying mechanism[J].Diabetes，2005，54（6）：1615-1625.

[4]Amour J，Brzezinska A K，Weihrauch D，et al.Role of Heat Shock Protein 90 and Endothelial Nitric Oxide Synthase during Early Anesthetic and Ischemic Preconditioning[J].Anesthesiology，2009，110（2）：317.

[5]Vladic N，Ge Z D，Leucker T，et al.Decreased tetrahydrobiopterin and disrupted association of Hsp90 with eNOS by hyperglycemia impair myocardial ischemic preconditioning[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol， 2011，301（5）：H2130-9.

[6]Fleming I，Busse R.Molecular mechanisms involved in the regulation of the endothelial nitric oxide synthase[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2003，284（1）：1-12.編辑/温灵慧

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