2型糖尿病免疫炎症研究

[摘要]目的：检测2型糖尿病患者外周血Th1/Th2淋巴细胞及血清高敏c-反应蛋白（hs-CRP）的水平，以探讨免疫炎症与2型糖尿病的关系。方法：运用三色荧光标记法流式细胞术检测外周血中Th1/Th2淋巴细胞，用ELISA法测定hs-crp。结果：①2型糖尿病患者Th1数，Th1/Th2比值与正常对照组相比明显降低（P<0.01），Th2数与正常对照组无明显差异。2型糖尿病患者外周血Th1淋巴细胞和HbA1c呈负相关关系（r=-0.688，P<0.01）。②2型糖尿病患者血清hs-CRP与正常对照组相比明显升高（P<0.05）。糖尿病患者血清hs-CRP浓度与胰岛素敏感性指数呈显著负相关（r=-0.38，P<0.01），与甘油三酯（r=0.33，P<0.05）、体重指数（r=0.42，P<0.05）和空腹血糖（r=0.46，P<0.05）有正相关关系。结论：2型糖尿病患者存在Th1/Th2淋巴细胞的失衡，血清hs-CRP水平与胰岛素抵抗程度有显著正相关，免疫炎症可能参与了2型糖尿病的发病。

[关键词]2型糖尿病；Th细胞；高敏c-反应蛋白；免疫炎症；流式细胞术

2型糖尿病患者存在细胞和体液免疫的异常已受到越来越多的关注，本研究通过测定外周血Th1和Th2淋巴细胞及血清hs-CRP水平，旨在进一步明确免疫炎症与2型糖尿病的关系。

一、材料与方法

（一）对象和材料

1、对象

正常对照组25例，男12例，女13例，健康体检者，年龄（50.5±6.0）岁，汉族，无糖尿病及其它自身免疫性疾病。糖尿病组：新诊断的2型糖尿病患者60例，男32例，女28例，系本院内分泌科住院患者，年龄（52.9±9.7）岁，44~78岁。入组患者均无糖尿病急慢性并发症，也无自身免疫性疾病、感染、肿瘤等。

2、试剂与仪器

PERCP标记的抗CD4单抗，PE标记的抗IL-4单抗，PITC标记的抗IFN-γ单抗，（均为鼠抗人）。FITC和PE，PERCP标记的鼠IgG1同型对照免疫球蛋白、佛波醇乙酯（PMA）、离子霉素（Ionomycin），布雷菲德菌素A（BFA）和Fix&Perm破膜剂均购自美国Caltag公司。hs-CRP试剂盒（晶美生物工程有限公司）；胰岛素（INS）试剂盒（天津九鼎生物技术有限公司）；流式细胞仪为美国Coul-ter公司EPICS-XL型。

（二）方法

1、Th1/Th2流式细胞术检测

肝素抗凝血5m，l淋巴细胞分离液分离单核细胞，将细胞数调整至1×106ml-1，将细胞悬液加入24孔细胞培养板中，加入刺激剂PMA（20μg/ml），离子霉素（1μg/ml）和蛋白质转运抑制剂BFA（2μg/ml）以阻止细胞因子向细胞外分泌。37℃、5%CO2环境下培养5小时，对细胞表面抗原进行染色，加入破膜剂进行固定-破膜打孔以利于细胞因子单抗进入细胞，进行细胞内细胞因子染色，每管加入10μlIFN-γ单抗和IL-4单抗，以相应的同种型对照IgG单抗作对照染色，应用流式细胞仪对分泌INF-γ的CD4+细胞Th1和分泌IL-4的CD4+细胞Th2进行检测。

2、血清hs-CRP的测定

取晨起空腹静脉血2m，l用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）测定。

3、血糖、胰岛素及相关指标的测定

空腹10小时取晨血5ml测定空腹血糖（FBG、葡萄糖氧化酶法）、空腹血清胰岛素（FINS放射免疫法）。HomaB胰岛素分泌指数=20×空腹胰岛素/（空腹血糖-3.5），是评价胰岛β细胞分泌功能的一个指标，胰岛素敏感性指数ISI=LN[1/空腹血糖（mmoL/L）×空腹胰岛素（mU/L）]是评价胰岛素抵抗的一个指标。糖化血红蛋白（HbA1c），免疫分析法，德国Ba-yer公司DC2000型HbA1c检测仪及检测试剂盒。

（三）统计方法

采用SPSS8.0统计软件包作统计学分析。资料均采用-x±s表示，组间比较用单因素方差分析，以P<0.05为有统计学意义。相关分析用直线相关。

二、结果

（一）2型糖尿病患者外周血Th1/Th2淋巴细胞与血清CRP及临床资料与正常组比较

2型糖尿病患者的Th1数，Th1/Th2比值较正常组显著下降（P<0.01），Th2数与正常组无明显差异。2型糖尿病患者血清CRP浓度显著高于正常对照组（P<0.05），HomaB较正常组显著下降（P<0.01）。

（二）2型糖尿病患者外周血Th1/Th2淋巴细胞及血清CRP水平与胰岛素敏感性指数等相关性分析

相关分析显示，2型糖尿病患者外周血Th1淋巴细胞值与HbA1c具有明显的相关性（r=-0.68，P<0.01），患者Th2及Th1/Th2与HbA1c之间无相关性（P>0.05）。Th2淋巴细胞值与HomaB具有明显的相关性（r=-0.54，P<0.01）。2型糖尿病患者血清CRP水平与胰岛素敏感性指数呈显著负相关（r=-0.38，P<0.01），与体重指数（r=0.42，P<0.05），甘油三酯（r=0.33，P<0.05），空腹血糖（r=0.46，P<0.05）有显著正相关；与年龄和空腹胰岛素等无相关性。

三、讨论

近年来，越来越多的研究表明：2型糖尿病存在着明显的细胞免疫和体液免疫异常。CD4+T辅助细胞（Th）是构成机体免疫系统的一种主要细胞，根据其分泌细胞因子的种类分为Th1、Th2和Th0三个亚群，Th1细胞主要负责细胞免疫应答、迟发性超敏反应（炎症反应）、Th2细胞与体液免疫有关，Th0是Th1和Th2细胞的前体细胞。生理条件下，机体的Th1细胞和Th2细胞处于相对平衡状态，在疾病状态下，这种平衡被打破，Th1、Th2细胞所致不同优势免疫应答与疾病的发生，发展，预后有关。近来Th1/Th2细胞与糖尿病的关系日益受到关注，Katz等认为Th1细胞有可能促进1型糖尿病的发生，而Th2细胞对1型糖尿病有保护作用，Almawi等认为1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，体液和细胞免疫均参与介导这一反应，Th1型细胞因子（IFN-γ、IL-2和TNF-α）通过直接促进细胞调亡和（或）上调选择性粘附分子的表达，导致了β细胞的破坏。同时Th1型细胞因子还促进了自身反应性T细胞在胰腺的浸润，从而更加强了β细胞的破坏。目前对2型糖尿病这方面研究比较少。

本研究通过流式细胞分析技术检测细胞内细胞因子，发现新发的2型糖尿病患者的Th1数和Th1/Th2比值低于正常对照组，本研究还发现，2型糖尿病患者Th1值与糖化血红蛋白呈负相关，Th2淋巴细胞值与HomaB具有明显的负相关，提示Th1细胞劣势所致的细胞免疫缺陷可能引起了高血糖的发生，Th2淋巴细胞的升高导致了胰岛β细胞分泌功能的下降。虽然Th2与正常人比无差异，但Th1细胞亚群的改变导致了Th2亚群的变化，Th2型细胞因子促进B细胞活化，而产生过量IgG，也可促进杀伤性T淋巴细胞克隆的过度激活，该作用与其他细胞因子和效应分子产生的细胞毒作用结合，可以引起胰岛β细胞死亡，Th2细胞因子可能也通过体液免疫途径参与了2型糖尿病患者的发病。CRP是机体组织受到各种损伤或炎症刺激后肝脏产生的急性期蛋白，近来研究发现CRP在新发现的糖尿病或在已诊断的2型糖尿病患者中明显增高，而在非糖尿病或仅有空腹血糖异常者中正常。

本组资料选择无其它急慢性内外科疾患的新发的2型糖尿病患者作为研究对象，排除炎症、血压、冠心病等对CRP的影响，研究CRP与2型糖尿病的关系。采用李光伟提出的胰岛素敏感性指数[ISI=1/（空腹血糖×空腹血胰岛素）]作为胰岛素抵抗程度的指标，发现2型糖尿病患者血清CRP浓度显著高于正常对照组（P<0.05）。提示2型糖尿病可能是细胞因子介导的炎症反应，炎症在糖尿病的发病机制起媒介作用。2型糖尿病组hs-CRP与IAI有显著负相关（r=-0.38，P<0.01），与体重指数（r=0.42，P<0.05），甘油三酯（r=0.33，P<0.05）和空腹血糖（r=0.46，P<0.05）有显著正相关，提示2型糖尿病患者血清CRP水平与胰岛素抵抗密切相关，CRP水平是2型糖尿病存在胰岛素抵抗的预测因子。

研究认为胰岛素对于肝脏急性时相蛋白的合成具有不同的作用，可促进白蛋白的合成而抑制纤维蛋白原和CRP的合成，胰岛素抵抗时，胰岛素敏感性降低则会抑制胰岛素的生理作用，导致CRP合成的增加。但也有研究认为炎症反应、免疫激活以及相应的代谢变化均受到神经-内分泌激素的调节，并同时影响这些激素的功能，构成复杂的神经-内分泌-免疫网络。免疫系统激活产生的各种炎症因子（如IL-6、TNF-α和CRP等）均能诱导胰岛素抵抗的发生。CRP水平的增高是胰岛素抵抗的诱因还是结果，有待进一步的阐明。

本研究从Th亚群角度及CRP水平进一步应证了免疫炎症与2型糖尿病的发生有密切的关系，为2型糖尿病发病机制的研究提供了新的资料。

参考文献：

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[2] BarbaraM， Brooks-Worrel，l Rattan Junejaetal. Cellular immune re-sponses to human islet proteins in antibody-positive type 2 diabeticpatients[J]. Diabetes， 1999； 48（5）： 983-988.

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