雷公藤内酯醇对EAE小鼠脊髓TNF-α\IL-12,和TGF-β1表达的影响

[摘要] 目的:观察免疫抑制剂雷公藤内酯醇(Tri)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型脊髓组织TNF-α、IL-12 和TGF-β1的影响。方法:采用MOG33-35、佐剂CFA、百日咳毒素免疫动物建立EAE模型,腹腔注射Tri治疗,制作脊髓石蜡切片行HE染色及LBF髓鞘染色,免疫组化染色观察TGF-β1、TNF-α和IL-12的表达,并行相关图像分析。结果:HE染色可见EAE组脊髓有“袖套样”炎性细胞浸润。LBF髓鞘染色可见EAE组小鼠脊髓髓鞘脱失。与佐剂组相比,EAE组TNF-α、IL-12表达增高(P<0.01或P<0.05), TGF-β1表达降低(P<0.05)。与EAE组相比,Tri治疗组TNF-α、IL-12表达降低(P<0.05),TGF-β1表达增高(P<0.05)。结论:Tri可明显改善EAE小鼠脊髓组织病理状况,可能与抑制TNF-α和IL-12等促炎性细胞因子,促进TGF-β1等保护性细胞因子的分泌有关。

[关键词] 雷公藤内酯醇;多发性硬化;实验性自身免疫性脑脊髓炎;转化生长因子-β1;肿瘤坏死因子-α;白介素-12

[中图分类号] R-332 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721(2010)05(c)-005-03

Effects of Triptolide on TNF-α、IL-12 and TGF-β1 in spinal cord ofEAEmice

REN Xiaorong1,2,FAN Hongcui1,2,YU Jiezhong1,JI Ning1,LIANG Liyun1,MA Cungen1,2*

(1.Institiute of Brain Science,Shanxi Datong University, Datong 037000, China;2.Department of Neurology, The First Clinical Medical College, Shanxi Medical University, Shanxi Province, Taiyuan 030001, China)

[Abstract] Objective: To observe the effects of Triptolide on TGF-β1、TNF-α and IL-12 in spinal cord ofEAEmice. Methods: EAE model was established with MOG35-55, Tri was intraperitoneally injected in treatment group, the spinal cord of mice were disseted and removed for paraffin section. These sections were used for HE, myelin staining and immunohistochemical stain on TGF-β1、TNF-α and IL-12. Results: For EAE models, HE stain showed typical “muff-like” inflammatory cell infiltration, and myelin staining showed demyelination in spinal cord. Compared with adjuvant group, the level of TNF-α and IL-12 in EAE group was increased (P<0.01or P<0.05), and the level of TGF-β1 was decreased(P<0.05). Compared with EAE group, TNF-α and IL-12 in Tri group was decreased (P<0.05), and the level of TGF-β1 was increased significantly(P<0.05). Conclusion: Tri can treat EAE mice effectively. The mechanism may be caused by depression of secretion of TNF-α, IL-12 and promotion ofTGF-β1.

[Key words] Triptolide; Multiple sclerosis; Experimental autoimmune encephalomyelitis; TGF-β1; TNF-α; IL-12

实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是一种Th1细胞介导的自身免疫性炎症性脱髓鞘疾病,与多发性硬化(MS)有许多相似之处。雷公藤内酯醇(Tri)是从雷公藤属植物中提纯出来的一种单体,具有抗感染、免疫抑制、抗肿瘤等多种生物活性[1],临床已被广泛应用于自身免疫性疾病,但在MS中研究较少。笔者利用Tri短期干预EAE,观察其对小鼠脊髓组织形态学、细胞因子TGF-β1、TNF-α和IL-12表达的影响,旨在进一步探讨EAE发病的免疫学机制及Tri治疗的作用机制,为雷公藤制剂治疗MS的临床应用提供充分的实验依据。

1材料与方法

1.1 动物

雌性C57BL/6黑色小鼠,8～10周龄,体重18～22 g。由中国医学科学院实验动物研究所提供。

1.2 药品和试剂

雷公藤内酯醇购自南京皮肤病研究所;髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)33-35,减毒百日咳毒素购自北京生物制品;兔抗小鼠TGF-β1抗体,兔抗小鼠 TNF-α抗体,兔抗小鼠 IL-12抗体,即用型SP免疫组化试剂盒,DAB染色试剂盒,多聚赖氨酸均购自北京博奥森生物工程有限公司。

1.3 EAE模型的复制

参照文献[2]方法改进,用0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)将MOG33-35稀释,然后将稀释液与等量含结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂(CFA)混合,用玻璃注射器抽提成油包水状,制成诱导EAE的抗原乳剂。供EAE组和Tri治疗组使用。利用0.9%NaCl溶液代替MOG33-35稀释液,参照上述方法制备乳剂,供佐剂组(CFA组)使用。乙醚麻醉后,从脊柱背侧后半部中线两侧分选4个进针点,EAE组和治疗组皮下注射抗原匀浆,佐剂组小鼠用CFA代替抗原匀浆,0.1 ml/只。记免疫当天为第0天(p.i.0)。各组于免疫后第0、2天分别腹腔注射百日咳毒素(PTX)1 600 ng/只作为免疫增强剂。

1.4 分组及给药

将41只小鼠随机分为3组,分别为:EAE组即模型组19只,Tri治疗组12只,佐剂组10只。各组于p.i.5(免疫后第5天)至p.i.15(免疫后第15天)按50 μg/(kg·d)腹腔注射相应药物,Tri治疗组注射Tri溶液;EAE组和佐剂组给予等量0.9%NaCl溶液。每日1次。

1.5 观察指标

造模38~40 d后,10%水合氯醛按0.1 ml/20 mg腹腔注射麻醉后,小鼠左心室灌注磷酸盐缓冲液至肝脏变白,再使用4%多聚甲醛至尾部僵直,解剖取脊髓(包括颈膨大,腰膨大)。制作石蜡切片。

1.5.1 HE染色及LFB 髓鞘染色,光镜观察组织形态学改变。

1.5.2用免疫组织化学法观察TGF-β1、TNF-α和IL-12的表达,并应用医学图像分析系统进行分析。

1.6 统计学方法

数据均采用均数±标准差(x±s)来表示,采用SPSS 13.0软件对所得数据进行分析处理。组间临床症状评分比较采用秩和检验,其余组间比较采用单因素方差分析,率的比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 脊髓形态学

HE染色发现EAE组小鼠脊髓炎性浸润呈典型的“袖套样”改变,浸润细胞以淋巴细胞和中性粒细胞为主,尤其腰膨大炎性浸润比较明显,其余脊髓节段浸润相对较轻,炎性浸润主要分布在脊髓前角白质、灰白质交界区及正中裂血管周围,并且炎性浸润部位及程度与临床症状密切相关。Tri治疗组小鼠脊髓实质中炎性细胞浸润明显减轻。佐剂组小鼠脊髓未见明显异常改变。

脊髓LFB髓鞘染色EAE组可见脊髓白质疏松,髓鞘不连续,有大小不等的片状脱髓鞘区。炎性细胞浸润弥散,灰白质受累,尤以灰白质交界区最重,前索及侧索内均有片状脱髓鞘区。Tri治疗组脊髓髓鞘脱失较轻。佐剂组小鼠脊髓未见明显改变。

2.2 TGF-β1、 TNF-α和IL-12免疫组化检测结果

TNF-α免疫组化染色表现为由血管渗出的淋巴细胞周围有不同程度着色。TGF-β1、和IL-12在血管周围、灰白质交界区表达明显。经图像分析系统测定并比较各组着色区染色程度,各组细胞因子计算平均积分光密度值,用SPSS 13.0统计软件对其表达,进行相关统计分析,数据呈正态分布,方差齐。结果见表1。

3讨论

EAE主要是由Th1细胞直接介导的以中枢神经系统病变为主的自身免疫性疾病,被公认为MS的理想动物模型。本实验形态学观察显示:脊髓炎性浸润呈典型的“袖套样”改变,浸润细胞以淋巴细胞和中性粒细胞为主,尤其腰膨大炎性浸润比较明显,炎性浸润主要分布在脊髓前角白质、灰白质交界区及正中裂血管周围,髓鞘破坏后表现为片状白质脱髓鞘,髓鞘结构松解或融合,以血管周围明显,说明髓鞘是炎症和免疫反应的靶位。这些与国外报道的MOG35-55 EAE模型相符[3],并且符合MS脱髓鞘为主的病理改变。

细胞因子是一组调节免疫应答的小分子多肽类因子,在免疫系统的调控中起到重要作用,在EAE的发病中不同CK作用不同。TNF-α与IL-12均属于促炎性细胞因子,TNF-α主要与Th1细胞介导的炎症反应有关,可诱导多种黏附分子、趋化因子、细胞因子(如IL-1,IL-6)活化。在急性期主要为浸润的炎性细胞、小胶质细胞呈现TNF-α免疫反应阳性,而恢复期则主要在星形胶质细胞中表达。有研究表明,血清中TNF-α浓度增高程度与EAE临床症状严重程度呈正相关[4]。在Lewis鼠模型中将TNF-α或IFN-γ注入大脑半球可加重EAE[5]。IL-12在Th1细胞分化上起重要作用,而且可诱导Th1细胞、NK产生IFN-γ[6]。Vandenbroeck K等[7]和Sergio D等[8]发现抑制IL-12可控制Th1细胞分化,并减轻EAE的病理变化。本实验研究显示,佐剂组脊髓TNF-α及IL-12的含量均较低,而EAE组两者的表达均明显升高(P<0.01或P<0.05),说明TNF-α及IL-12在EAE形成和发展过程中过度表达,是促炎因子和Th1占据优势的表现。可以推测EAE的病变与Th1细胞的免疫功能亢进及其分泌的促炎因子增多有关。

调节性T细胞(Treg)是具有免疫调节功能的T细胞群体,它在免疫耐受中起关键作用,能限制过度的免疫反应引起的组织损伤[9]。Viglietta V等[10]和Haas J等[11]分别研究证实MS患者Treg本身具有功能障碍。TGF-β1是由Treg所分泌,它可抑制T、B细胞和巨噬细胞的活化;下调黏附分子并抑制白细胞和内皮细胞的黏附,保护血脑屏障[11];和细胞毒性淋巴细胞抗原(CTLA-4)共同中止免疫应答;和其他免疫抑制分子一起维持免疫耐受状态[11]。本实验结果显示:与佐剂组相比,EAE组TGF-β1的含量明显降低(P<0.05),说明在EAE形成和发展过程中,TGF-β1有异常降低的现象,是Treg免疫功能低下的表现。

雷公藤内酯醇(Tri)是中药雷公藤的有效成分,具有抗感染、抗肿瘤、免疫抑制等作用。既往对Tri的研究证实了它对CD4+和CD8+T淋巴细胞均有抑制作用,可显著降低EAE大鼠的病情,促进T淋巴细胞的凋亡,减轻炎性细胞在中枢神经系统(CNS)的浸润程度;证实了Tri可通过下调表达ICAM-1恢复内皮细胞正常的细胞膜和细胞间结构,起到对血脑屏障的保护作用。本实验研究显示,经Tri治疗后, TNF-α及IL-12的含量明显降低(P<0.05),TGF-β1的含量,明显升高(P<0.05)。说明Tri可通过下调促炎性细胞因子的含量,同时,上调内源性TGF-β1的含量,从而维持免疫耐受状态,恢复机体免疫稳定状态进而抑制EAE的进展。

[参考文献]

[1]丁晓凌,周国雄.雷公藤内酯醇诱导肿瘤细胞凋亡的机制[J].国际肿瘤学杂志,2006,33(4):259-261.

[2]Mendel I, Kerlero N, Rosbo D, et al. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells[J]. Eur J Immunol,1995,25(7): 1951-1959.

[3]Alfred RO, Geoffrey ML, Nancy HR. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoprotein induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanism in C57BL/6 mice[J]. J Immunology,2003,171(1):462-468.

[4]吕佩源,徐俊英.TNF-α在实验性变态反应性脑脊髓炎中变化的意义[J].J Apoplexy and Nervous Disease,2002,19(1):22-23.

[5]Sun D, PerryV, WellerR, et al. Cytokine-induced enhancement of autoimmune inflammation in the brain and spinal cord: implications for multiple sclerosis[J]. Neuropathology & Applied Neurobiology,2004,30(4):374-384.

[6]Wendy T, Bruce D, Jay H, et al. Signaling by IL-12 and IL-23 and the immunoregulatory roles ofSTAT4[J]. Immunological Reviews,2004,202 (1):139-156.

[7]Vandenbroeck K, Alloza I, Gadina M, et al. Inhibiting cytokines of the interleukin-12 family: recent advances and novel challenges[J]. J Pharm Pharmacol, 2004, 56(2):145-160.

[8]Sergio D, Steven M. Defects in the interferon-gamma and interleukin-12 pathways[J].Immunological Reviews,2005,203(1):38-47.

[9]Becher C,Stoll S,Bopp T,et al.Toll-like receptors on regulatory T cells: expanding immune regulation[J].Trends Immunol,2006,27(8):387-393.

[10]Viglietta V,Baecher Allan C,Weiner HL,el al. Loss of functional suppression by CD4+CD25+ regulatory T cells in patients with multiple sclerosis[J]. J Exp Med, 2004,199(7):971-979.

[11]Haas J,Hug A,Viehover A,et al. Reduced suppressive effect of CD4+CD25+ high regulatory T cells on the T cell immune response against myelin oligodendrocyte glycoprotein in patients with multiple sclerosis [J].Eur J Immunol, 2005,35(11):3343-3352.

(收稿日期:2010-04-13)

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