构建遗传修饰小鼠过程中外源核酸传递方法的研究进展

摘 要：传统构建遗传修饰小鼠的方法有2种，一种是采用显微注射技术将特定核酸序列传递到小鼠受精卵或胚胎体内，另一种是将小鼠的胚胎干细胞导入到囊胚中。较为广泛应用的是采用显微注射技术将特定核酸序列传递到小鼠受精卵或胚胎体内，即核酸传递方法，该方法可以通过注射方法、转染方式及性腺组织介导进行核酸传递。综述构建遗传修饰小鼠过程中的核酸传递方法，包括原核注射、囊胚显微注射、受精卵核酸电转染、输卵管核酸电转染、精子介导的基因转移、卵巢组织注射等方法的研究进展，并对核酸传递方法的进一步利用和发展方向进行展望。

关键词：遗传修饰小鼠; 核酸物质传递; 显微注射; 电转染; 基因编辑

Abstract： There are two traditional methods to build the genetically modified mouse model， one method is to use the microinjection to transfer specific nucleotide sequence into the fertilized eggs or embryos of mouse， while the other is to introduce the embryonic stem cells of mouse into the blastocyst. The first method， that is， nucleic acid transferring method， is widely used which can transfer the nucleic acid through injection method， transfection method and gonadal tissue mediate. The research progress of nucleic acid transferring method in the process of building genetically modified mouse model was summarized including pronucleus injection， blastocyst microinjection， the nucleic acid electrotransfection of fertilized eggs， the nucleic acid electrotransfection of oviduct， sperm-mediated gene transfer， ovarian tissue injection， etc. Then， the further usage and development direction of nucleic acid transferring method were prospected.

Key words： Genetically modified mouse;Nucleic acid transfer;Microinjection;Electrotransfection;Gene editing

傳统的构建基因遗传修饰小鼠方法是对体外培养的小鼠胚胎干细胞进行基因遗传修饰，通过显微操作注射到囊胚中，最终在得到的嵌合体小鼠中进行筛选，得到基因遗传修饰稳定遗传的小鼠[1-3]。但该技术需要长时间筛选胚胎干细胞的单克隆细胞株，并且嵌合体小鼠的筛选周期较长。近年来，随着基因编辑技术的发展，对小鼠的基因组进行基因编辑变得简单和快速，同时，将核酸序列传递到小鼠受精卵或胚胎内的方法也得到发展，构建基因修饰动物的方法更加多元化。基因编辑技术主要包括锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）、TALE核酸酶（transcription activator like effector nucleases，TALENs）及CRISPR/Cas9系统（CRISPR/Cas9 system）等[4-6]，均可以在靶位点处切割DNA，导致DNA双链断裂（double strand breaks，DSBs），并通过DNA损伤修复的两条途径——非同源末端连接（non-homologous ending-joining，NHEJ）或同源重组（homologous recombination，HR）实现对目的基因序列的敲除或插入[7]，从而对基因序列进行定点编辑。其中，CRISPR/Cas9系统因设计简单，操作成本低，被广泛应用于构建基因修饰动物[8]。该技术是将Cas9蛋白和sgRNA （mRNA或者质粒元件）传递到小鼠受精卵中，进行基因组的编辑，从而获得遗传修饰小鼠[9]。目前，关于如何将Cas9蛋白和sgRNA的核酸传递到受精卵中是影响高效构建遗传修饰小鼠的关键步骤。当前，原核显微注射是应用最广泛的方法，该方法是将核酸通过特制的玻璃针注射到小鼠受精卵的细胞核中。由于其操作过程需要昂贵的显微操作仪器，并且对操作人员的熟练程度要求极高[10]，因此，在对核酸高效传递到小鼠的受精卵或早期胚胎研究过程中，先后出现了多种将核酸传入小鼠受精卵或胚胎中的新方法，包括注射、DNA转染、性腺组织介导等方法，新的研究方法取得了不错的效果，但核酸传递效率有待进一步提高。本文对构建遗传修饰小鼠过程中的核酸传递方法进行综述，分析各方法的优缺点，以期为构建其他模式动物的遗传修饰模型提供理论基础。

1 通过注射方法进行核酸传递

1.1 原核注射

原核注射（pronuclear injection）是将外源基因通过显微操作技术注射到小鼠受精卵的原核中，使得含有目的基因的DNA片段随机整合到小鼠基因组中，从而产生遗传修饰小鼠[10]。原核注射技术自从面世以来，一直是研究热点。近年来，随着ZFNs、TALENs以及CRISPR/Cas9等新型基因编辑系统的出现，研究者们将基因编辑系统与原核注射技术相结合，构建基因敲除或敲入的遗传修饰小鼠。2010年Carbery等[11]结合了ZFNs与显微注射技术，成功构建了第1只基因敲除小鼠，2013年Sung等[12]首次将TALENs和显微注射技术相结合成功构建基因条件性敲除小鼠，Yang等[13]利用CRIPSR/Cas9技术和显微注射技术成功构建了第1只基因条件性敲除小鼠，2013年李劲松等[14]将sgRNA和Cas9蛋白注入患有白内障小鼠的受精卵中后，发现有1/3新生小鼠的白内障被治愈，并且能稳定遗传到下一代，表明白内障遗传疾病可以得到根治。2015年Liang等[15]首次将CRISPR-Cas9技术用于人类胚胎基因编辑。因此，原核注射目前仍然是构建遗传修饰小鼠主要的方法。虽然原核注射与基因编辑技术结合相比于传统基于胚胎干细胞的构建遗传修饰小鼠方法简单，但所需设备昂贵，对试验人员操作技术熟练程度要求极高。

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