小檗碱对Aβ2535致SHSY5Y细胞株炎症反应中TNFα及I型受体表达的干预作用

材料

1.1 药物与试剂 人神经母细胞瘤细胞株SHSY5Y购自中国科学院上海生命研究院；10%的胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司；RNA提取剂Trizol购自Promega公司；TNFR1，βactin多克隆抗体购自Santa Cruz公司；逆转录酶及Taq酶购自Promega公司；PCR引物由上海捷瑞公司合成；TNFα ELISA试剂盒和LDH试剂盒购自南京建成生物工程公司；ECL试剂盒及PVDF膜购自Millipore生物技术有限公司。

1.2 仪器 ELX800酶标仪（美国Biotex公司）；TP600PCR仪（日本Takara公司）；Western电泳仪（美国BIORAD公司）；免疫印迹结果由美国BIORAD公司的GS670型图像分析仪进行分析。

2 方法

2.1 细胞培养 SHSY5Y细胞用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1链霉素的DMEM培养液在37 ℃，5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养。

2.2 SHSY5Y细胞的处理 将SHSY5Y细胞1×106个/孔接种于6孔板中，待细胞完全贴壁后弃上清，用含不同浓度BBR（0，1×10-6，1×10-5 mol·L-1）或吲哚美辛（2×10-4 mol·L-1）[3]的培养液预处理2 h，加或不加Aβ2535（5×10-6 mol·L-1）继续培养24 h。分组如下，正常对照组：细胞不做任何处理；AD模型组：小檗碱（0 mol·L-1）+Aβ2535；吲哚美辛组：吲哚美辛（2×10-5 mol·L-1）+Aβ2535；小檗碱低剂量组：小檗碱（1×10-6 mol·L-1）+Aβ2535；小檗碱高剂量组：小檗碱（1×10-5 mol·L-1）+Aβ2535。收集细胞上清及细胞备检。

2.3 培养液中细胞LDH活性的检测 各组细胞取其上清液按试剂盒说明书通过比色法测定LDH活性。

2.4 酶联免疫吸附法检测TNFα水平 采用双抗体夹心ELISA法按试剂盒说明书检测各组细胞上清液中TNFα水平。

2.5 RTPCR检测TNFR1 mRNA的表达 用Trizol充分裂解细胞，提取总RNA。紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。逆转录酶AMV催化合成cDNA；以适量cDNA为模板，在Taq DNA聚合酶催化下，扩增TNFR1和甘油醛3磷酸脱氢酶（GAPDH）基因片断。TNFR1引物序列为：上游引物5′CAGGATCCGATAGTGTGTGTCCCCAAG3′；下游引物5′ CCCAAGCTTCTCAGTGCCCTTAACATTC3′，产物全长504 bp。内参照GAPDH引物序列为：上游引物 5′ GTGAAGGTCGGAGTCAACG3′；下游引物 5′ GGTGAAGACGCCAGTGGACTC3′，产物全长223 bp。反应条件为：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 5 min，35个循环扩增产物。在2%琼脂糖凝胶上电泳，并在紫外投射分析仪上对电泳条带进行拍照。应用计算机分析系统对电泳条带的宽度和亮度进行亮化处理，以测量得到的TNFR1/ GAPDH mRNA的比值作为TNFR1 mRNA的相对含量。

2.6 Western blot检测TNFR1蛋白的表达 用含蛋白酶抑制剂的裂解液提取细胞蛋白，用BCA法测定组织液中蛋白含量，取50 μg蛋白上样，用10%SDSPolyacrylamid胶电泳后转至PVDF膜，10%脱脂奶粉的TBST封闭2 h，分别加入1∶200稀释的TNFR1及βactin的多克隆抗体常温下孵育5 h。PBST 洗膜后，与过氧化物酶标记二抗室温孵育2 h。应用试剂ECL显影于胶片。以测量得到的TNFR1/ βactin 蛋白的比值作为TNFR1蛋白的相对含量。

2.7 统计学方法 计量资料用±s表示，采用SPSS 17.0统计软件进行方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 细胞上清液LDH活性比较 Aβ2535干预后细胞上清液中LDH活性与对照组相比明显升高（P<0.05）；吲哚美辛及小檗碱干预则可以显著降低上清液中LDH活性（P<0.05）；其中吲哚美辛对LDH的改善作用较小檗碱更为明显（P<0.05）；而小檗碱高剂量组的改善作用优于低剂量组（P<0.05），见表1。

表1 小檗碱对Aβ2535诱导SHSY5Y细胞LDH活性、TNFα水平、TNFR1 mRNA及蛋白表达的影响（x±s，n=5）

Table 1 Effects of berberine on expressions of LDH， TNFα， TNFR1 mRNA and protein in Aβ2535injured SHSY5Y cells（x±s，n=5）

注：与对照组比较1）P<0.05；与模型组比较2）P<0.05；与吲哚美辛组比较3）P<0.05；与小檗碱低剂量组比较4）P<0.05。

3.2 细胞上清液TNFα的比较 与对照组细胞相比，Aβ干预后细胞上清液中TNFα水平升高约9.5倍（P<0.05）；吲哚美辛及小檗碱干预的细胞TNFα水平则可下降至2/5左右（P<0.05）；但各组之间无显著性差异，见表1。

3.3 细胞TNFR1 mRNA及蛋白水平的比较 与对照组相比，AD模型组细胞的TNFR1 mRNA和蛋白水平显著升高（P<0.05）。而吲哚美辛、小檗碱等药物干预可下调TNFR1 mRNA和蛋白的表达（P<0.05），其中小檗碱高剂量组下调作用更为显著，明显优于吲哚美辛及低剂量组（P<0.05），与对照组TNFR1的表达无显著性差异，见表1。

4 讨论

近年来随着对AD发病机制的深入研究，脑内的慢性炎症机制成为继老年斑、tau蛋白磷酸化及淀粉样变性后的另一重要病理特征[4]。目前已知参与AD病理生理过程的细胞因子有白介素1（IL1），TNFα，转化生长因子β（TGFβ）等，其作用机制可能为：①刺激淀粉样前体蛋白（APP）的启动子上调APP的表达[5]；②影响神经元胆碱酯酶（AChE）的表达以及调节其活性[6]；③诱导营养不良性轴突生长并增加磷酸化tau蛋白水平[7]；④活化星形胶质细胞，促使TNFα等炎症因子水平进一步升高。

在正常脑内环境中，神经元和小胶质细胞均不表达或低表达炎症因子。因此，在脑部受到损伤或是发生慢性神经退行性病变时炎症因子来源于可能为：①少量外周淋巴细胞及外源性炎症因子侵入中枢神经系统参与神经炎症反应[8]；②Aβ在脑内异常沉积导致内源性炎症因子生成，诱发神经免疫炎症反应。外周淋巴细胞及炎症因子因血脑屏障的滤过作用，不是中枢神经系统炎症的主导因素，而在脑内异常沉积的Aβ引发的神经免疫炎症反应才是AD的神经变性过程中的核心原因。目前，Aβ通过与受体相互作用导致细胞内信号传导、激活小胶质细胞产生多种炎症因子的作用已得到证实[9]，而具有抗炎效果的NSAIDs能通过抑制多种炎症因子起到保护作用[10]。但Aβ对神经细胞是否有直接的促炎症作用及对炎症炎症因子的受体是否有调节作用尚不明确。除副作用较大的NSAIDs外，是否有其他副作用较小的药物可以通过抑制神经系统炎症反应而起保护作用。

临床研究证明，小檗碱以0.4 g，每天3次的剂量口服即有抑制炎症因子的作用[2]，且能透过血脑屏障直接作用于皮层神经及海马[11]，并对铝过负荷致小鼠慢性脑损伤及其他中枢神经系统疾病具有保护作用及潜在的治疗价值[1213]，但小檗碱对AD病理生理过程中炎症因子的调节作用尚未有文献报导。因此，本实验通过Aβ直接干预SHSY5Y细胞，模拟AD病理生理环境，观察Aβ直接作用神经细胞后炎症因子TNFα及其Ⅰ型受体TNFR1的表达及其小檗碱的调节作用。

TNFα是一种多向性细胞因子。除神经元毒性外，TNFα还能增加血脑屏障的通透性，促进淋巴细胞透过血脑屏障[14]，同时上调脑内毛细血管内皮细胞黏附分子（ICAM1）的表达[15]。它的各种生物学作用通过2种不同的细胞表面受体传递信号——Ⅰ型受体（TNFR1）和Ⅱ型受体（TNFR2）。基因敲除实验及受体特异性激动剂抗体研究证实2种受体与不同蛋白质起反应，激活不同的信号传导途径。多数已知TNFα的生物活性由TNFR1介导，而通过TNFR2的信号传递较少，主要发生在免疫系统细胞内。而TNFα与TNFR1结合后，通过促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂肌醇（PKC）及蛋白激酶A（PKA）途徑激活一种能促进多种致炎性因子基因转录的核因子——核转录因子κB（NFκB），参与多种炎症相关基因的转录调控，在介导中枢神经炎症反应起到突出的始动及媒介作用。研究证实TNFRⅠ封闭肽具有与TNFR1结合并拮抗TNFα促炎效应的作用[16]。因此，推测抑制TNFR1的基因表达及TNFα水平同样可拮抗中枢神经系统的炎症反应，保护神经细胞。

在本实验的AD细胞模型中，培养上清中LDH活性明显增加，提示在Aβ干预下细胞膜受损严重，其机制可能与TNFα水平升高及TNFR1的表达上调有关。药物干预后培养上清中LDH活性明显下降，提示小檗碱有减轻Aβ细胞毒性的作用，其作用机制可能与抑制TNFα水平及下调TNFR1的表达有关。与小檗碱相比，吲哚美辛对LDH的调节作用显著，而对TNFα的作用无明显差异，但对TNFR1表达的调节却存在显著性差异。因此，认为作为经典的非甾体类消炎药，吲哚美辛虽然可显著降低LDH，但作为优势抗炎机制的COX途径，同时也能导致严重的消化道不良反应。而小檗碱虽然对TNFα的调节与吲哚美辛相差不大，但对TNFR1的作用明显优于非甾体类消炎药，其中尤以高剂量小檗碱下调TNFR1的作用最为明显，几乎可达到正常对照组的水平，对防治AD有重要的作用。

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Intervention effect of berberine on expressions of TNFα and receptor

type I in Aβ2535induced inflammatory reaction in SHSY5Y cell lines

XU Jing， ZHANG Hong*， YANG Fan， YU Jinxin

（Department of Geriatrics， Drum Tower Hospital Affiliated to Medical School of Nanjing University， Najing 210008， China）

[Abstract] Objective： To investigate the effect of berberine on expressions of tumor necrosis factor α （TNFα） and receptor type I （TNFR1） in Aβ2535induced inflammatory reaction in SHSY5Y cell lines. Method： The 5 μmol·L-1Aβ2535 was used to treat SHSY5Y cells for 24 hours， in order to establish the Alzheimer′s disease （AD） model. Before modeling， berberine was given for pretreatment for 2 hours. The experiment included the normal control group， the AD model group， and indometacin low dose and high dose groups. Spectrophotometry was adopted to detect the activity of LDH. Meanwhile， the level of TNFα was determined by ELISA， and the expression of TNFR1 genes was detected by RTPCR. Result： Compared with the normal control group， the AD cell model group showed significant increase in LDH， TNFα， and TNFR1 gene and protein expressions in the culture media. After intervention with berberine， the activity of LDH and TNFα reduced in cell supernatant. The intervention with berberine could dowegulate TNFR1 gene and protein expressions， particularly 1， 10×10-6 mol·L-1 berberine showed a more notable effect in regulating TNFR1. Conclusion： Berberine has the protective effect in Aβinduced inflammatory injury in SHSY5Y cells. Its mechanism may be related to the expression of its anti inflammatory factor TNFα and its type I receptor TNFR1. Specifically， its regulation to TNFR1 shows dose dependence.

[Key words] Alzheimer′s disease； Amyloidβ peptide； inflammatory reaction； berberine； tumor necrosis factor α； tumor necrosis factor type I receptor

doi：10.4268/cjcmm20130913

[責任编辑 张宁宁]

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