基于单核,,巨噬细胞炎症模型的络风宁1号抗炎机制初探

摘要：目的 制备单核 巨噬细胞炎症模型，并观察络风宁1号含药血清对模型细胞增殖的影响。 方法 采用脂多糖（LPS）体外诱导建立单核 巨噬细胞炎症模型，造模的同时加入不同浓度的络风宁1号及匹伐他汀钙含药血清干预，共同孵育24 h后，收集细胞上清，ELISA法检测炎症因子基质金属蛋白酶 9（MMP 9）水平。 结 果 与空白组相比，模型组THP 1单核细胞显著升高（ P < 0.01）；不同浓度络风宁1号含药血清干预后，高浓度组的抑制作用最明显（ P <0.01）。 结论 单核 巨噬细胞炎症模型制备成功，基于此模型，络风宁1号含药血清可以抑制LPS对炎症细胞的增殖作用，这可能是其抗炎症、防治冠心病不稳定性心绞痛的主要机制之一。

关键词： 单核 巨噬细胞；络风宁1号；基质金属蛋白酶

中图分类号 ：R329.2 R285.5 文献标识码：A

doi： 10.3969/j.issn.1672 1349.2014.10.038

文章编号：1672 1349（2014）10 1240 04

人THP 1细胞属于急性髓系白血病细胞，是体外研究单核 巨噬细胞功能的良好替代品，该细胞经佛波酯（PMA）诱导后分化为巨噬细胞[1]，而巨噬细胞能够分泌肿瘤坏死因子α （TNF α）、白细胞介素6（IL 6） 和基质金属蛋白酶（MMPs）等多种炎性细胞因子及趋化因子，进而促进动脉粥样硬化（AS）发生和发展。含药血清能更好地反映药物尤其是中药复方在体内通过血液循环产生药理效应的真实过程，有利于从细胞水平上探讨中药复方的作用机制，理论上提高了体外实验的真实性和可靠性。王显教授在学习和总结古今医家理论及经验的基础上，对动脉粥样硬化的病因病机及其中西医结合防治策略进行创新性思考和探索，提出动脉粥样硬化“络风内动”学说[2]，指出“络风内动”乃急性冠脉综合征的重要病机之一，并创制络风宁1号方用于冠心病不稳定型心绞痛的治疗，前期研究已证明络风宁1号方可显著改善不稳定型心绞痛的临床症状，但其发挥作用的分子生物学机制尚不明确。结合既往研究，推测其通过抑制血管内炎症反应来发挥作用。本研究通过脂多糖（LPS）刺激人单核 巨噬细胞系建立炎症细胞模型，采用血清药理学方法，以期为研究络风宁1号的抗炎作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药物与试剂 所用中药均来自北京中医药大学第一附属医院中药房。匹伐他汀钙片（北京双鹤药业股份有限公司，国药准字H20080737）；佛波酯（PMA）（P1585）购自美国Sigma公司；脂多糖（tlrl eblps）及Triozol Reagent 均为Invivogen Life technologies产

1.1.2 动物与细胞 SD（Sprague Dawley）雄性大鼠24只，体重250 g±10 g，由北京维通利华实验动物中心提供，许可证编号为SCX K（京）2012 0009。THP 1 单核细胞由中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心提供。

1.1.3 实验仪器 MultiSkan FC 酶标仪购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 含药血清制备 24只SD雄性大鼠，随机分为空白组、络风宁1号组和匹伐他汀钙组，分别以生理盐水、15倍于人的络风宁1号药液及15倍于人的匹伐他汀钙药液灌胃，剂量为1.2 mL/100 g，每日1次，连续7 d。于末次给药2 h后，腹主动脉采血，3 000 g常温离心后取上清液，收集各组含药血清，56 ℃水浴30 min，灭活补体后分装于1.5 mL EP管中，置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 细胞培养与鉴定 用含10%胎牛血清的RPMI Medium 1640培养基重悬原代细胞，根据细胞生长情况2 d换1次液，4 d传1次代。选用6代～10代细胞用于实验。

1.2.3 确定PMA最佳诱导浓度 调整细胞浓度为 3.5×105个/L，接种于96孔板，每每孔100 μL；每孔加入等体积的不同浓度PMA溶液，使其终浓度分别为40 nmol/L、80 nmol/L、160 nmol/L、320 nmol/L、640 nmol/L， 每组6个复孔，置于37 ℃，5%CO2培养箱中，分别诱导24 h及48 h。弃上清，每孔加入100 μL 1 mg/mL MTT培养基溶液，继续培养4 h后；弃上清，每孔加150 μL DMSO，振荡5 min～10 min，于酶标仪550 nm处测各孔A值。

1.2.4 确定络风宁1号方含药血清最佳作用浓度 向已分化好的巨噬细胞中依次加入5%空白血清、5%中药血清、5%西药血清、10%空白血清、10%中药血清、10%西药血清、15%空白血清、15%中药血清、15%西药血清、20%空白血清、20%中药血清、20%西药血清。 每组6个复孔，置于37 ℃，5%CO2培养箱中，孵育 24 h。

1.2.5 确定LPS最佳刺激浓度 向已分化好的巨噬细胞中加入100 μL浓度分别为20 ng/mL、200 ng/mL、2 μg/mL、20 μg/mL的LPS溶液， 同时加入等体积含20%空白对照血清的培养基，则LPS终浓度分别为10 ng/mL、100 ng/mL、1 μg/mL、10 μg/mL，每组6个复孔，置于37 ℃，5%CO2培养箱中，共同孵育24 h。

1.2.6 细胞上清MMP 9水平检测 细胞培养方法同上，实验分组详见表1。分别收集各组细胞上清液至无菌EP管中，置于-20 ℃冰箱保存，采用酶联免疫吸附法，按ELISA试剂盒说明书进行操作，1 d～2 d内检测完毕。

2.3 不同浓度含药血清对THP 1源性巨噬细胞增殖的影响 5%浓度的各组含药血清对细胞有显著增殖作用，与空白血清组 比较差异有统计学意义（ P <0.01）， 故不选此浓度；10%浓度的中药血清与10%浓度的空白血清相比抑制细胞增殖（ P <0.01）；15%与20%空白血清组与5%空白血清组相比，则显示出血清对细胞的毒性（ P <0.01）；故以10%浓度的含药血清为最佳浓度。详见表3。

2.4 不同浓度LPS对人THP 1源性巨噬细胞增殖的影响 LPS可刺激细胞增殖，1 μg/mL组与对照组相比有明显增殖作用（ P <0.01）。详见表4。

3 讨 论

动脉粥样硬化斑块从稳定变为易损的过程涉及炎症、免疫、代谢、凝血等多个环节，其中炎症反应是引起斑块不稳定的关键因素[3]。人THP 1细胞作为体外研究单核 巨噬细胞功能的良好替代品，经PMA诱导后分化为巨噬细胞[1]，而巨噬细胞能够分泌TNF α、IL 6和MMPs等多种炎性细胞因子及趋化因子。噻唑蓝（MTT）法是一种用于检测细胞的存活和生长的简便方法，在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比[4]，据此可检测细胞的相对数和相对活力。

首先，筛选PMA的最佳作用浓度。研究表明[5，6]，PMA可以使体外培养的单核细胞分化为巨噬细胞。由于THP 1单核细胞为悬浮细胞，MTT法测定细胞存活相对数，就能够反映经PMA诱导后单核细胞的贴壁情况，即巨噬细胞转化率。本实验通过选取不同浓度的诱导剂及不同的诱导时间，筛选出巨噬细胞转化率最高的PMA浓度，即为最佳诱导浓度。而含胎牛血清的完全培养基使细胞不断增殖，不利于单核细胞贴壁分化[1]，故本实验选用基础培养基以促进细胞贴壁分化{JP3。对于PMA的诱导浓度，文献一般采用80 nmol/L～ 200 nmol/L浓度诱导单核细胞分化为巨噬细胞，其中选用80 nmol/L～160 nmol/L浓度居多，故本实验设定40 nmol/L、80 nmol/L 、160 nmol/L、320 nmol/L、 640 nmol/L 5个浓度梯度。PMA作用24 h后，在40 nmol/L～80 nmol/L巨噬细胞转化率随PMA浓度升高而升高，在160 nmol/L～640 nmol/L巨噬细胞转化率随PMA浓度升高而降低。作用48 h后，随PMA浓度的升高巨噬细胞转化率变化趋势与作用24 h的相同；但在相同浓度下，作用48 h巨噬细胞转化率低于作用24 h。THP 1单核细胞与PMA（80 nmol/L）培养24 h，由悬浮细胞向贴壁细胞转化，呈阿米巴样生长，并伸出伪足，呈现巨噬细胞形态，转化率达90%。所以本实验选择80 nmol/L作为诱导THP 1单核细胞分化为巨噬细胞的最终浓度。

其次，确定了含药血清的最佳浓度。血清药理学是指用含有药物成分的血清施加于体外实验反应体系的一种半体内实验方法[7]。本实验结果表明，5%浓度的各组含药血清对细胞有显著增殖作用，与空白血清组比较差异有统计学意义（ P <0.01），故不选此浓度；10%中药血清组与10%空白血清组相比抑制细胞增殖（ P <0.01）；15%与20%空白血清组与5%空白血清组相比，则显示出血清对细胞的毒性（ P <0.01）。故以10%浓度的含药血清为最佳浓度。

在确定以上两个浓度的基础上，确定最佳造模浓度。LPS、丝裂原即有丝分裂原，因可导致细胞有丝分裂而得名，包括LPS、美洲商陆（PWM）、刀豆蛋白A（ConA）等。LPS在体内与可溶性CD14（sCD14）或细胞膜上的CD14（membrane boundCD14moleeule，mCD14）受体结合，形成LPS蛋白复合物（LpSbindingprotein，LBP），激发细胞免疫应答。有研究表明[8 10]，LPS浓度在1 μg/mL、作用24 h可充分诱导活化的巨噬细胞。LPS通过与TLR4受体结合导致转录因子NF κB激活是引起大量炎性介质表达的重要始动因素[11]。本实验结果表明，LPS可刺激细胞增殖，10 ng/mL与100 ng/mL组与对照组相比，细胞无明显增殖（ P >0.05）；1 μg/mL 组与对照组相比有明显增殖作用（ P <0.01），故以1 μg/mL的LPS为最佳造模浓度。经过反复验证，单核 巨噬细胞炎症模型制备成功，并将其用于后续实验。

动脉粥样硬化是一种慢性、动态、复杂的炎症性疾病。针对动脉粥样硬化的研究难点以及动脉粥样硬化引起急性心脑血管事件的发病特点，王显教授提出动脉粥样硬化“络风内动”学说[12 14]，经过10余年的临床研究，认为络风内动乃是急性心脑血管事件的重要病机，并在该学说指导下，研制出以祛风除湿、益气活血为主要功效的络风宁1号方，强调在益气活血同时，应加强“风药”的使用。该方以徐长卿、威灵仙、党参、黄芪为主药，方中药物可能通过抗炎、调脂、抗栓、镇静、镇痛等作用稳定斑块，防止急性冠脉综合征的发作。

基质降解是动脉粥样硬化高风险的标志，导致心肌梗死和中风。基质金属蛋白酶是影响动脉粥样斑块稳定性的重要生物酶，能够特异性的与细胞外基质相结合，降解细胞外基质，促使内皮细胞迁移，导致斑块纤维帽降解和斑块破损[15]。

Peter等[16]在apoE / 小鼠动脉粥样硬化病变中诱导巨噬细胞过表达MMP 9，结果发现巨噬细胞过表达活化的MMP 9时显著增加弹力蛋白的降解，诱导有效的斑块破裂。敲除 TLR4 的 ApoE / 小鼠模型显示，动脉粥样硬化斑块体积明显减少，斑块中的脂质和巨噬细胞浸润均降低，显著下调了促炎因子表达水平，从而使斑块趋于稳定而不易破裂[17]。Blich等[18]将实验研究和临床研究的结果相互验证，结果发现：正常小鼠腹腔巨噬细胞上清液中 TNF α、MMP 9、IL 1 与单核细胞趋化蛋白 1水平明显增加，而TLR2和TLR4基因敲除后的小鼠腹腔巨噬细胞上清液中上述细胞因子无明显增加。临床研究发现心肌梗死患者血浆类肝素酶水平与稳定型心绞痛患者和健康人相比明显升高，而且肝素酶染色的易损斑块与稳定斑块的病理标本中，易损斑块的肝素酶染色是增加的。由此得出被激活的巨噬细胞过量分泌相关炎性细胞因子，导致斑块易损性增强，并可能与TLR2和TLR4基因调控有关。也有实验证明，激活TLR2、TLR4、TLR9可上调MMP 1、MMP 2、MMP 3、MMP 8、MMP 9 mRNA的表达[19]。其中MMP 9与动脉粥样硬化关系密切，可作为冠状动脉粥样硬化斑块不稳定的标志物[20]。目前证实LPS通过TLR4介导MMP 9及蛋白水解酶表达[21]，两者可降解细胞外基质引发AS斑块不稳定[22，23]。因此，基于单核 巨噬细胞炎症 模型的成功制备，观察络风宁1号含药血清对炎症因子MMP 9 表达的影响，结果表明：络风宁1号含药血清呈剂量依赖型抑制MMP 9表达。但其通过何种调控机制来发挥作用仍不清楚，可能通过抑制TLR4/NF κB炎症信号转导通路的活化来发挥抗炎作用。

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（收稿日期：2014 04 11）

（本文编辑 郭怀印）

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