塞来昔布对脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型炎症因子的影响

材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株与试剂 塞来昔布（纯度≥98%，Sigma公司），二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司）；小鼠RAW264.7巨噬细胞（中国科学院上海细胞库）；DMEM高糖培养基（Hyclone公司）；胎牛血清（GemCell公司）；青链霉素混合液（100×）（北京索莱宝科技有限公司）；脂多糖（LPS L2880，Sigma公司）；MTT（Biosharp生物科技）；一氧化氮（NO）试剂盒（碧云天生物公司）；肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA试剂盒（武汉博士德公司）；前列腺素E2（PGE2）ELISA试剂盒（美国Cayman公司）。

1.1.2仪器 酶标仪（美国Molecular Devices公司）。

1.2方法

1.2.1小鼠RAW 264.7巨噬细胞的培养 将RAW 264.7巨噬细胞接种在含10%胎牛血清（<0.5 EU/ml）、1%青霉素和链霉素的高糖DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱内培养。当细胞覆盖率达到约90%时，弃掉上清，直接加入37℃培养基吹打传代。取对数期细胞用于后续实验。

1.2.2 LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型的建立 取对数期生长的RAW 264.7细胞以每孔20×103个细胞接种于96孔细胞培养板中，待24 h细胞贴壁后，设置正常对照组和LPS模型组，每组6个复孔。正常对照组以无血清DMEM培养基孵育细胞，LPS模型组则以含1 μg/ml LPS的无血清DMEM培养基孵育细胞，孵育24 h后，观察细胞形态变化，并收集细胞培养基测定炎症因子NO及TNF-α、PGE2含量[8]。

1.2.3 MTT法检测塞来昔布对LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞的细胞毒性试验 取对数期生长的RAW 264.7细胞以每孔3×103个细胞接种于96孔细胞培养板中，待24 h细胞贴壁后，设置正常对照组、LPS模型组、塞来昔布组（塞来昔布+LPS）及DMSO溶剂对照组（DMSO+LPS），每组6个复孔。正常对照组和LPS模型组先以无血清DMEM培养基孵育细胞，塞来昔布组分别以含终浓度为40.00、30.00、10.00、8.00、3.00、1.00、0.30、0.10、0.03 μmol/L塞来昔布的无血清DMEM孵育细胞，DMSO溶剂对照组则在无血清DMEM中加入等体积DMSO孵育细胞。按上述处理方式孵育细胞1 h后，除正常对照组采用无血清DMEM继续孵育外，其余各组再加入终浓度为1 μg/ml LPS刺激细胞，24 h后收集各孔培养基，在每孔中加入5 g/L MTT 10 μl，补足DMEM至100 μl（MTT终浓度为0.5 g/L），继续培养4 h后弃上清，每孔加入150 μl DMSO，震荡10 min，在570 nm处测量各孔的吸光度。

1.2.4塞来昔布对LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症因子分泌的影响 取对数期生长的细胞以每孔20×103个细胞接种于96孔的细胞培养板中，待24 h细胞贴壁后，设置正常对照组、塞来昔布组（塞来昔布+LPS）及DMSO溶剂对照组（DMSO+LPS），每组6个复孔。各组处理方式同“1.2.3”，塞来昔布组仅采用8 μmol/L塞来昔布孵育细胞。以上三组分别处理完毕后，收集细胞培养基测定炎症因子NO及TNF-α、PGE2的含量。

1.2.5 NO、TNF-α和PGE2的含量测定 按上述处理方式收集各孔细胞培养基后，分别采用Griess法测定NO及ELISA法测定TNF-α、PGE2含量，操作参照试剂盒说明书进行。

1.3统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行处理，计量资料以x±s表示，两样本均数的比较采用Student T-Test检验，多样本组间均数的比较采用One-way ANOVA检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症细胞模型的建立

作用24 h后在显微镜下进行形态学观察，正常对照组RAW 264.7巨噬细胞体积较小，呈边缘明亮的类圆形，偶有细长触角，符合巨噬细胞形态；经1 μg/ml LPS刺激24 h后，细胞体积明显增大并伸出大量伪足，呈菱形、梭形、长条形等不规则形状，且细胞内有大量空泡。与正常对照组相比，LPS模型组NO及TNF-α、PGE2含量均明显增高（P<0.01）（图1、图2）。

2.2 MTT法测定塞来昔布对LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞的细胞毒性试验

经MTT法检测，LPS模型组及DMSO溶剂对照组的细胞存活率与正常对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。40、30 μmol/L塞来昔布组的细胞存活率较正常对照组明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；10.00、8.00、3.00、1.00、0.30、0.10、0.03 μmol/L塞来昔布组的细胞存活率则与正常对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05），且8.00 μmol/L塞来昔布组的细胞存活率接近100%，故选用8 μmol/L塞来昔布进行后续实验。

2.3塞来昔布对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症因子分泌的影响

与正常对照组相比，DMSO溶剂对照组炎症因子NO、TNF-α及PGE2的含量均明显增高（P<0.01）；与DMSO溶剂对照组相比，8 μmol/L塞来昔布组能明显抑制LPS誘导的RAW 264.7巨噬细胞炎性因子NO、TNF-α及PGE2的分泌（均P<0.01）。

3讨论

炎症反应是多细胞因子通过调节促炎和抗炎系统之间的平衡而参与炎症发生、发展的过程。目前，在体外细胞炎症模型制作中，LPS是最主要、作用最强的促炎手段。LPS是革兰阴性杆菌细胞壁外膜的主要组分，能诱导活化炎症细胞引起炎症反应，从而导致多种促炎性细胞因子的产生，促炎性细胞因子的分泌可诱导炎性细胞的进一步激活，从而导致过度或失控的炎症反应，最终引起组织器官的炎性病理损伤。

AS具有慢性炎症反应特征的病理过程，其发展始终伴随炎症反应。单核/巨噬细胞是AS炎症反应的重要效应细胞，一方面，巨噬细胞产生多种炎性细胞因子，促进血栓形成，扩大斑块面积，增加斑块的不稳定性，在AS病理过程中发挥关键作用；另一方面，巨噬细胞也可产生如白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）等抗炎因子，增加AS斑块的稳定性，进而起保护作用[9]。

炎症因子TNF-α、NO及PGE2作为经典的急性炎症早期细胞因子，常用于衡量炎症模型成功与否的标准[10-11]。其中，TNF-α是巨噬细胞在炎症反应中产生的主要促炎细胞因子，在机体中可影响包括细胞增殖、分化及凋亡等一系列细胞功能的调节，其表达增加还可促进氧自由基的产生导致内皮功能紊乱，是AS进程中非常重要炎性因子[12]。NO是一种有重要生物学意义的无机小分子，具有杀灭细菌等病原体微生物活化巨噬细胞的作用[13]，能够介导炎症反应。NO由一氧化氮合酶（NOS）经一系列氧化还原反应生成，在动脉粥样硬化浸润的巨噬细胞中，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达增高，由iNOS衍生的过量NO诱导的硝化应激会引起过度炎症反应，加重动脉粥样硬化[14]。PGE2是COX-2的主要代谢产物，COX是催化花生四烯酸（AA）合成各种内源性前列腺素（PGs）和血栓素（TXs）的限速酶。COX主要分为COX-1和COX-2，其中COX-2酶为诱导型酶。COX-2通常被认为主要与炎症等过程中PGs的生成相关，与AS的发生发展成正相关。COX-2表达局限在粥样斑块的巨噬细胞/泡沫细胞、平滑肌细胞和内皮细胞中，在炎性因素影响下COX-2及其产物PGE2可被迅速诱导表达，促进AS炎症反应的发生和发展[15]。本实验结果显示，1 μg/ml LPS诱导24 h后，RAW 264.7巨噬细胞发生了明显的活化的形态学改变，炎症因子NO、TNF-α及PGE2分泌水平亦较正常对照组显著上升，差异有统计学意义（P<0.01），提示已成功建立LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型。

虽然较多实验发现COX-2抑制剂能减轻血管炎症、减少单核细胞浸润、改善血管壁细胞功能而延缓AS进程、增加斑块稳定性，从而减少AS血栓事件[16]，但也有COX-2抑制剂加重AS[17]或对AS无影响[18]的报道。为探讨COX-2选择性抑制剂对AS及相关心脑血管疾病的影响及可能机制，在成功建立LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型基础上，本实验初步观察了COX-2选择性抑制剂塞来昔布对LPS诱导的巨噬细胞部分炎症因子分泌的影响。MTT结果显示，0.03～10.00 μmol/L的塞来昔布对LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞无明显细胞毒性（与正常对照组比较，P<0.05）。以细胞存活率接近100%的8.00 μmol/L塞来昔布作用于LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞后，可明显抑制LPS诱导的RAW 246.7巨噬细胞炎症因子NO、TNF-α及PGE2的分泌。塞来昔布通过选择性抑制COX-2酶可抑制炎症因子PGE2的生成，但塞来昔布通过何种机制抑制炎症因子NO及TNF-α的生成？此外，塞来昔布在抑制NO、TNF-α及PGE2等炎症因子分泌的同时，为何却可增加AS及相关心血管事件的发生？因此，有必要在此炎症细胞模型基础上展开进一步研究。

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（收稿日期：2017-02-24 本文编辑：祁海文）

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