药用植物毛状根的诱导及其应用

总结了植物毛状根培养体系在次生代谢物的生产、生物合成机制及调控基因的研究、植物基因工程、生物转化以及药物蛋白中的应用，旨在为其他药用植物毛状根的培养及利用提供参考依据。

[关键词] 毛状根； 药用植物； 次生代谢产物； 发根农杆菌； 生物转化

[收稿日期] 2013-11-30

[基金项目] 全国优秀博士学位论文作者专项资金项目（201188）；首都中医药研究专项（13ZY03）；北京市优秀人才培养个人项目（2011D005018000002）

[通信作者] 王秀娟，教授，研究方向为中药药效与作用机制及中药资源可持续利用，Tel：（010）83911624，E-mail： wxj0517@sina.com

[作者简介] 张萌，硕士研究生，E-mail： zhangmeng8846@126.com

植物毛状根培养是植物组织培养中的一种，因其生长不依赖外源植物激素、合成次生代谢物能力强且稳定、具有生物转化功能以及繁殖能力强等优点，可以在医药领域用于生产药物，近年来受到众多学者的关注。目前已经有近百种药用植物成功诱导出毛状根，并广泛应用于多种研究之中。本研究介绍了目前药用植物毛状根的诱导情况并总结了植物毛状根应用现状，为其进一步研究和利用提供参考。

1 药用植物毛状根的诱导

1.1 毛状根的发根机制

毛状根（hairy roots）是发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes感染植物后，在植株创伤表面诱导产生的一种特殊表现型。早在1907年，Smith和Townsend就发现发根农杆菌能够诱导植物产生毛状根，此后，学者们发现无论是发根农杆菌还是根癌农杆菌A. tumefaciens，其致病原因均是由大分子质粒引起的[1-2]，但发根农杆菌的致病质粒与其他Ti质粒（根瘤诱导质粒）功能既有差异又有联系[3]。直到1982年，美国科学家Chilton[4]发表文章阐述其发根机制：发根农杆菌中Ri质粒上T-DNA进入宿主植物细胞引发了毛状根的产生。

Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个约250 kb的大质粒，其上面存在2个与转化有关的功能区，即T-DNA（转移区）和Vir（致病区）。T-DNA的主要功能是在转化时进入植物细胞并插入到寄主植物基因组中，表达决定毛状根生长和冠瘿碱合成的基因；Vir区的作用是协助T-DNA区完成转化。Vir区上有7个操纵子 VirA-G，转化时，植物伤口产生小分子酚类化合物与VirA的表达产物结合，激活其他Vir基因，使T-DNA被剪切、转移并最终整合到宿主细胞基因组中。因此，单子叶植物不能合成特异性小分子酚类化合物是其难以被侵染诱导出毛状根的主要原因[5-7]。

1.2 药用植物毛状根诱导情况

目前，已有近百种药用植物成功诱导出毛状根，总结发现其中76%为草本植物，也有少量藤本及木本植物，比例分别占到7%，17%；在植物学分类方面，已诱导出毛状根的药用植物科属分类较为分散，其中豆科、茄科、菊科和唇形科占有相对较大的比例（表1）。

自20世纪90年代起，一些学者就开始致力于研究药用植物毛状根，发根农杆菌作为影响毛状根诱导的主要因素也一直备受关注。目前，诱导药用植物毛状根的常用菌株有A4，ATCC15834，R1601，LBA9402，R1000，C58C1，1.2556，R1600，ACCC10060等，在已诱导出毛状根的药用植物中，27%使用的是A4菌株，20%使用发根农杆菌ATCC15834，14%使用R1601，其余菌株的使用均在10%以内，不同植物对于不同菌株的敏感性差异较大。部分学者利用农杆菌ATCC15834，C58C1，A4，R1601等诱导出木本或藤本药用植物的毛状根，例如杜仲[8]，绞股蓝[9]，南方红豆杉[10]等，但在菌株选择上依然很盲目，需要进一步探索其规律。

2 应用

2.1 在次生代谢物生产中的应用

毛状根因其遗传性状稳定、生物合成能力强等诸多优点，比悬浮细胞更适合用于次生代谢物的生产。利用发根农杆菌诱导的毛状根生产次生代谢产物，其含量比原植物药高，如通过杜仲毛状根的培养来获得桃叶珊瑚苷药用成分，其质量分数最高可达30.105 mg·g^-1，且高于自然根及皮，高产根系E1进行大规模繁殖培养能获得理想的药用物质，有望替代传统药源[8]。

很多研究都显示，适当的改变培养条件，如培养基和碳源的选择、外源激素添加及配比，以及不同诱导子的加入，均可以有效地提高次生代谢物产量。研究发现金铁锁毛状根在1/2MS培养基中皂苷的总产量最大[11]。丹参毛状根培养基中葡萄糖浓度的增加能够规律的促进丹参毛状根中迷迭香酸、丹酚酸B等的产生和积累，且其促进作用大于蔗糖[12]。也有学者发现，葡萄糖和蔗糖对阿拉伯芥毛状根中萜类和甾醇类成分的影响与糖信号参与调控顺式异戊烯基转移酶和植物甾醇途径酶有关[13]。

在培养基中加入不同的细胞分裂素或生长激素，也会对毛状根的生长及次生代谢产物的积累发生作用。研究发现，单用或组合应用6-BA时，会对毛状根的生长有抑制作用，但对一些次生代谢产物有显著促进作用，NAA，IAA，IBA单用或组合应用可促进某些次生代谢产物的积累[14-16]，2，4-D可明显提高白芥毛状根中芥子油苷的含量，但KT对该成分没有影响[17]。而诱导子的加入可以对某一类次生代谢产物特异调节，单独或组合使用可以达到调控代谢的目的。如生物诱导子酵母提取物，可显著促进牛角瓜中强心苷[18]、甘草中总黄酮[19]的合成；非生物诱导子Ag⁺可使水飞蓟毛状根中水飞蓟素的含量明显提高[20]。

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