高温淀粉酶高产菌株筛选及产酶条件优化

摘要 为筛选高温淀粉酶高产菌株，利用淀粉酶水解圈作筛选模型，从稻田中采集土样，筛选得到产淀粉酶能力较高的菌株E10。为提高菌株产酶能力，进行了碳源种类及浓度，氮源种类及浓度，无机盐种类及浓度，pH值，种龄及接种量、温度、时间的单因素试验，并对发酵培养基及发酵条件进行了L9（34）正交优化试验。结果表明：最佳产酶发酵培养基为2.0%麸皮、0.1%硝酸钾、0.25%氯化钙，最适初始pH值为6.0。最适产酶条件为种龄24 h，接种量7 mL，于36 ℃下培养48 h。在优化条件下，菌株产酶活力可达180.94 IU/mL。

关键词 高温淀粉酶；高产菌株；筛选；发酵条件

中图分类号 TQ925+.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）07-0240-04

Screening of High-yield Strain Producing Thermostable Amylase and Optimization of Enzyme Production

YI Zheng-xuan ZHAO Tong SHI Xuan WANG Zheng LI Li-heng *

（College of Bioscience and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha Hunan 410128）

Abstract In order to screen a high-yield strain producing thermostable amylase，starch hydrolysis circle was employed as a screening model. The E10 strain achieved from the paddy field soil has high capacity of enzyme production. In order to improve the capability of enzyme production of E10，the single factor experiments was conducted for the kinds and concentrations of carbon source，the kinds and concentrations of nitrogen source，the kinds and concentrations of inorganic salt，pH value，seed age，inoculate volume，temperature and time，then the L9（34） orthogonal optimization test for the fermentation medium and conditions was carried out. The results showed that the best fermentation medium of the enzyme production of E10 was 2.0% wheat bran，0.1% KNO3，0.25% CaCl2，initial pH value of 6.0. The optimal fermentation conditions of the enzyme production of E10 were 24 hours of seed age，7 mL of inoculates volume，36 ℃ of culture temperature，48 hours of time. Under the optimized conditions，the enzyme production of E10 reached 180.94 IU/mL.

Key words thermostable amylase；high-yield strain；screening；fermentation condition

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物中，是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种[1]。20世纪60年代以来，由于酶法生产葡萄糖，以及用葡萄糖生产异构糖浆的大规模工业化生产，淀粉酶的需求量越来越大，几乎占酶制剂总产量的50%以上。淀粉酶为作用于淀粉、糖原等α-1，4-葡聚糖，水解α-1，4-糖苷键的酶。根据酶水解产物异构类型的不同可分为α-淀粉酶（EC3.2.1.1）与β-淀粉酶（EC3.2.1.2），水解产物为糊精、麦芽寡糖、麦芽糖和葡萄糖[2]。耐高温淀粉酶通常是指最适反应温度为90～95 ℃、热稳定性90 ℃以上的淀粉酶，是淀粉加工中有重要用途的一种酶[3]。耐高温淀粉酶与一般细菌淀粉酶在液化淀粉方面相比，有节约能源、降低成本等优点，且耐高温淀粉酶稳定性好，保存条件范围宽，易于储存和运输，因此广泛应用于酿酒、食品、医药、纺织和环境治理等行业[4]。由于淀粉酶的种类繁多，用途较广，各国在对淀粉酶产生菌的筛选方面都做了大量研究工作。虽然很多微生物都能产生淀粉酶，但真正适用于工业化生产需要的菌株仍然很少，特别能耐高温的淀粉酶产生菌更少，在淀粉酶生产过程中选择适合的菌株仍然非常重要[5]。本试验以稻田土样作为材料，筛选出能耐高温的淀粉酶产生菌株，并对其发酵产酶条件进行优化，进一步提高产酶能力，为其最终能适用于工业化生产，带来巨大经济效益做前期准备工作。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试样品与试剂。土样为湖南农业大学附近稻田中土壤。试剂为淀粉、3，5-二硝基水杨酸、牛肉膏、蛋白胨等（国药集团化学试剂有限公司）。

1.1.2 仪器。V5000型可见光分光光度计（上海元析仪器有限公司），华普达YXJ-2高速电动离心机（常州市华普达教学仪器有限公司），HH-60 数显恒温搅拌循环水箱（常州市华普达教学仪器有限公司），QYC-2102全温培养摇床（上海新苗医疗器械制造有限公司），TOMY SX-500高压蒸汽灭菌锅（日本TOMYKOGYOCD.LTD），SW-CJ-1B（U）单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）。

1.1.3 培养基。①斜面培养基：牛肉膏0.3 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 0.5 g，琼脂粉2.0 g，水100 mL；pH值7.0。②筛选培养基：可溶性淀粉2.0 g，蛋白胨0.5 g，NaCl 0.5 g，琼脂粉2.0 g，水100 mL；pH值7.0。③种子培养基：可溶性淀粉2.0 g，酵母膏0.5 g，蛋白胨0.5 g，NaCl 0.5 g，KH2PO4 0.1 g，水100 mL；pH值6.0；150 r/min培养（6～60 h）。④基本发酵培养基：麸皮3.0 g，K2HPO4 0.1 g，NaNO3 0.1 g，水100 mL；pH值7.0。⑤基本培养条件：40 ℃，150 r/min培养48 h。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株筛选与鉴定。初筛（A）：称取土样10 g，加入至90 mL无菌水中，70 ℃处理30 min，静置30 s制成菌悬液，再用无菌水稀释至10-6，分别取10-4、10-5、10-6的菌悬液0.1 mL于筛选平板涂布均匀。于37 ℃倒置培养24 h。在平板上滴加碘液，菌落周围如有无色透明圈出现，说明该菌株能产生淀粉酶，挑选水解圈大、菌落小的单菌落数株，斜面编号保存，发酵培养并测定高温淀粉酶活力，选择产酶活力最大的菌株进行复筛。

菌株复筛：取产酶活力最大的菌株1环于90 mL无菌水中，70 ℃处理30 min后，静置及稀释。在筛选培养基上培养，待菌落长成后选择水解圈大、菌落小的菌株，进行发酵培养并测定淀粉酶活力。经4轮复筛（B、C、D、E）之后，选择产酶活力最大的E10号菌株作为试验菌株。

菌种的鉴定：参见《常见细菌系统鉴定手册》[6]等文献中的方法以及依据biolog鉴定系统结果进行。

1.2.2 淀粉酶活力的测定。酶活力的测定采用DNS法[1]。淀粉酶活力定义：在70 ℃，pH值为7.0条件下，淀粉酶1 min催化淀粉水解生成1 μmol麦芽糖表示1个酶活力单位。

1.2.3 发酵培养基优化试验。发酵培养基成分初定：在基本发酵培养基基础上，分别改变碳源种类（可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、大米粉、玉米粉、麸皮）及浓度（1%、2%、3%、4%、5%、6%），氮源种类（酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、硝酸钠、硝酸钾、硫酸铵）及浓度（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%），无机盐种类（磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸铁、氯化钠、硫酸铜）及浓度（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%），不同pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0），在基本培养条件下培养，测定其淀粉酶活力，根据所测定的结果确定最佳碳源种类及浓度、氮源种类及浓度、无机盐种类及浓度、pH值。

发酵培养基优化试验：选择碳源浓度、氮源浓度、无机盐浓度、初始pH值采用正交分析试验软件进行L9（34）试验设计，分析确定最适产酶发酵培养基配方[7]。

最优发酵培养基验证：配制最优发酵培养基，进行最优发酵培养基优化的验证。

1.2.4 发酵条件优化试验。发酵条件初定：采用最优发酵培养基，分别接入不同种龄的种子，用不同的接种量（1、3、5、7、9、11 mL），不同培养温度（30、33、36、40、45、50 ℃）及不同培养时间（12、24、36、48、60、72 h），测定其淀粉酶活力，根据所测定的结果确定最佳种龄、接种量、培养温度和时间。

发酵条件优化试验：选择种龄、接种量、培养温度及时间，采用正交分析试验软件进行L9（34）试验设计和分析确定最适产酶发酵条件。

最优发酵条件验证：采用上述最优发酵培养基和最优发酵条件，进行最优发酵条件的验证。

2 结果与分析

2.1 初筛结果

如图1所示，淀粉酶产生菌周围有明显水解透明圈，菌落形态为细菌，圆形隆起，有皱褶，挑选20株水解圈大、菌落较小的菌株，编号A1～A20，进行发酵培养，测定酶活，初筛结果如表1所示。从表1的初筛结果可以看出，产淀粉酶活力最大的是A19产生菌。

2.2 复筛结果

从初筛结果中挑选产酶活力最高的A19菌株进行分离纯化，在分离培养平板上进行培养，待菌落长成后选择透明圈较大、菌落小的菌株进行发酵培养并测定淀粉酶活力。4轮复筛之后，选择产酶活力较大的菌株作为本试验的出发菌株。复筛结果如表2所示。从表2的复筛结果可以看出，产酶活力较大的菌株为E10，因此用E10菌株作为本试验的供试菌株。

2.3 菌种染色结果

从图2可知，菌株E10经革兰氏染色鉴定，属于G+型细菌；芽孢染色结果表明，芽孢中生，圆柱形，大小与菌体直径一致（图3）；鞭毛染色结果表明为周生鞭毛（图4）。

2.4 菌株发酵培养基的优化

2.4.1 碳源种类对菌株E10的产酶能力影响。当碳源分别为可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、大米粉、玉米粉和麸皮时，细菌E10培养液淀粉酶活力分别为40.82、37.70、40.43、27.02、75.50、110.49 IU/mL，则麸皮产酶活力最高；由于麸皮中含有丰富的蛋白质、糖类、淀粉、纤维素、维生素、微量元素等，在发酵培养基中可以为细胞合成提供碳架，为微生物的正常生长提供能量和生长素，因此细菌E10培养液中淀粉酶活力最高。

2.4.2 碳源浓度对菌株E10的产酶能力影响。当碳源麸皮的质量分数为1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%时，细菌E10培养液淀粉酶活力分别为80.49、115.08、120.71、77.78、37.45、34.32 IU/mL，则麸皮3.0%时产酶活力最高；酶活力大小开始随麸皮浓度增大而增大，当达到一定浓度时，酶活力不再上升，此时酶活力达到最大值，继续增加麸皮浓度，发酵培养基营养过剩，菌体生长旺盛，产酶能力减小，酶活力又随着麸皮浓度的增大而减小。

2.4.3 氮源种类对菌株E10产酶能力的影响。当氮源分别为酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、硝酸钠、硝酸钾和硫酸铵，细菌E10培养液淀粉酶活力分别为38.07、32.87、42.46、92.05、115.82、32.76 IU/mL，硝酸钾产酶活力最高；硝酸钾作为无机氮源，微生物可以直接利用于菌体细胞物质（氨基酸、蛋白质、核酸等）和含氮代谢物的合成，有机氮源营养过剩，菌体生长过快反而不利于产酶；并且使用硝酸钾生产成本低，有利于提高酶生产利润，因此使用更广泛。

2.4.4 氮源浓度对菌株E10产酶能力的影响。当氮源硝酸钾的质量分数为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%时，细菌E10培养液淀粉酶活力分别为94.79、105.77、90.51、95.35、89.58、64.64 IU/mL，则硝酸钾0.1%时产酶活力最高；酶活力大小开始随硝酸钾浓度增大而增大，当达到一定浓度时，酶活力达到最大值，继续增加硝酸钾浓度，发酵培养基营养过剩，酶活力又随着硝酸钾浓度的增大而减小。

2.4.5 无机盐离子种类对菌株E10产酶能力的影响。当无机盐分别为磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁、氯化钠和硫酸铜时，细菌E10培养液淀粉酶活力分别为102.42、79.53、133.86、43.62、106.32、33.57 IU/mL，氯化钙产酶活力最高；氯化钙作为无机盐时，钙离子是细胞的结构成分，参与和维持微生物的代谢活动，维持微生物的酸碱平衡，维持细胞渗透压，有利于菌株吸收营养成分，是淀粉酶产生的促进剂。

2.4.6 无机盐离子浓度对菌株E10产酶能力的影响。当无机盐氯化钙的质量分数为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%时，细菌E10培养液淀粉酶活力分别为88.27、92.93、109.12、128.47、122.33、122.14 IU/mL，则氯化钙0.20%时产酶活力最高；酶活力随氯化钙质量分数增大而增大，当达到一定浓度时，酶活力达到最大值；氯化钙浓度继续增大，细胞膜渗透压发生改变，影响菌体的生长和代谢。因此酶活力随着氯化钙浓度的增大而减小。

2.4.7 初始pH值对菌株E10产酶能力的影响。当培养液初始pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0时，细菌E10培养液的淀粉酶活力分别为98.51、117.30、121.40、102.42、92.18、80.65 IU/mL，则pH值为7.0时产酶活力最高，为最适pH值；酶的化学本质是蛋白质，在水溶液环境中的解离状态和行为，都受到H+的影响。酶的催化作用决定于酶活性中心及一些必需基团的解离状态，这就需要一定的pH环境使各必需基团处于适当的解离状态，使酶发挥最大活性，这一状态下的pH值称为最适pH值。

2.4.8 发酵培养基优化试验结果。以麸皮（碳源）、硝酸钾（氮源）、氯化钙（无机盐离子）、初始pH值为因素，每个因素取3个水平，采用正交分析试验软件进行L9（34）试验设计和分析，各因素水平见表3，分析结果见表4。由表4可以看出，试验条件下优化水平的最佳组合为A1B2C3D1。在麸皮、硝酸钾、氯化钙、pH值等各因素中，氯化钙影响最为显著，麸皮影响最小。因此，可以确定最适产酶发酵培养基配方为：2.0%麸皮、0.1% 硝酸钾、0.25% 氯化钙、初始pH值为6.0。

2.4.9 最优发酵培养基验证结果。采用上述试验条件下优化水平的最佳组合，即2.0%麸皮、0.1%硝酸钾、0.25%氯化钙、初始pH值为6.0作发酵培养基配方，并与对照（处理1）的结果进行对比。优化后酶活力达到155.48 IU/mL，超过处理1的结果（137.40 IU/mL）。因此，可以确定最佳发酵培养基为2.0%麸皮、0.1%硝酸钾、0.25%氯化钙、初始pH值为6.0。

2.5 菌株发酵条件的优化

2.5.1 种龄对菌株E10产酶能力的影响。当种龄为6、12、24、36、48、60 h时，细菌E10培养液淀粉酶活力分别为67.78、72.16、131.09、116.24、54.75、48.24 IU/mL，种龄24 h时产酶活力最高；种龄是指种子培养的时间。种龄长短关系到种子活力强弱，种龄为24 h时，种子处于活力旺盛的对数期，可使菌体在发酵过程中适应期缩短，有利于酶的产生；超过24 h，种龄过长，菌株活力减弱，进入死亡期，代谢产物增多，酶活力减小。

2.5.2 接种量对菌株E10产酶能力的影响。当接种量为1、3、5、7、9、11 mL时，细菌E10培养液淀粉酶活力分别为65.57、65.94、123.82、77.85、70.41、68.92 IU/mL，接种量为5 mL时产酶活力最高；接种量的大小决定了菌株在发酵中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵菌株繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌污染的机会；当种龄一定时，接种量小，进入产酶高峰需要时间长；5 mL的接种量是菌株繁殖进入高峰期的最佳接种量，产物生成迅速，酶活力最高；接种量过大，菌体生长旺盛，引起发酵培养基内溶氧不足及前期营养消耗过快，影响产物合成，酶活力减小。

2.5.3 温度对菌株E10产酶能力的影响。当培养温度分别为30、33、36、40、45、50 ℃时，细菌E10培养液淀粉酶活力分别为80.09、82.13、95.16、109.67、65.01、42.31 IU/mL，40 ℃培养时产酶活力最高；温度低，菌体生长缓慢，酶产生需要时间长，难于进入产酶高峰期，此时酶活力较小；40 ℃时培养，菌体很快进入对数生长期，产酶活性最高；温度超过40 ℃、菌体容易衰老死亡，产生过多废物，影响酶的生成。

2.5.4 培养时间对菌株E10产酶能力的影响。当菌株E10发酵培养时间为12、24、36、48、60、72 h，培养液淀粉酶活力分别为66.32、76.37、97.76、106.86、70.04、50.69 IU/mL，36 h前属于发酵前期，是菌株的生长阶段，产酶量低，酶活力较小；36～48 h菌体产生孢子，产酶量增加，酶活力增高；48 h时，菌株进入迅速生长期，达到产酶高峰，此时为最佳产酶时间；之后产酶进入平稳状态，再延长培养时间，酶活力反而下降，因为底物被利用，浓度降低，菌体生长废物多，都不利于酶的产生。

2.5.5 发酵条件优化试验结果。以种龄、接种量、温度、时间为因素，每个因素取3个水平，采用正交分析试验软件进行L9（34）试验设计和分析（表5）。由表6可看出，试验条件下优化水平的最佳组合为A2B3C1D2。结果与处理6相符合，无需进行验证。因此，可以确定最佳发酵条件是种龄24 h，接种量7 mL，温度36 ℃，培养48 h。

3 结论与讨论

本试验从湖南农业大学附近稻田土壤筛选出的菌株E10产酶活力最高，其产酶能力大小通常会受到碳源种类及浓度、氮源种类及浓度、无机盐离子种类及浓度、初始pH值、种龄、接种量、温度和时间等多种因素影响，综合以上各种因素对菌株E10的产酶活力影响，得出最适发酵培养基配方是2.0%麸皮、0.1%硝酸钾、0.25%氯化钙、初始pH值为6.0。最佳发酵条件是种龄24 h，接种量7 mL，温度36 ℃，培养48 h。在最适发酵培养基和最佳发酵条件下培养，淀粉酶活力高达180.94 IU/mL。该菌株如果再进一步进行诱变处理，酶活力还有提升空间。

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