1株海洋来源产阿魏酸酯酶菌株的筛选及其对木质纤维材料的降解能力

材料的降解能力进行研究，以期为挖掘海洋来源阿魏酸酯酶资源奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 海水样品采自潍坊滨海开发区海域（属于莱州湾南部，于2014年8月采集），样品的处理方法见文献[7]。

1.1.2 试剂 阿魏酸乙酯，购自Sigma-Aldrich公司；阿魏酸标准品，购自阿拉丁试剂公司；PCR扩增相关试剂和DL15000 Marker，购自TaKaRa公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；木聚糖酶（50 000 U/g），购自江苏锐阳生物科技有限公司；麦麸，购自当地面粉厂；除乙腈为色谱纯外，其他常规试剂为国产分析纯。

1.1.3 仪器 ABI9700 PCR扩增仪；LC-20A高效液相色谱仪，日本岛津；DYY-6C型核酸电泳槽，北京六一生物科技有限公司；GENE GENIUS凝胶成像系统，美国Syngene公司；SW-CJ-1FD洁净工作台，江苏苏净集团有限公司。

1.1.4 培养基 （1）筛选培养基：0.05%氯化钙，1%氯化钠，0.05%磷酸氢二钾，0.05%磷酸二氢钾，0.1%硫酸铵，0.005% 硫酸镁，2%琼脂，pH值7.0～7.2。每个平板倒 20 mL 筛选培养基，加入0.3 mL过滤除菌的10%（体积分数）溶于二甲基甲酰胺（DMF）的阿魏酸乙酯，立即摇匀，直至呈现云雾状；（2）发酵培养基：1%氯化钠，0.5%硫酸铵，0.1% 酵母粉，0.05%磷酸氢二钾，0.05%磷酸二氢钾，0.5%阿魏酸乙酯，pH值7.0～ 7.2。

1.2 试验方法

1.2.1 平板法初筛 将样品的稀释液涂布于筛选培养基上，20 ℃恒温培养3 d，观察是否出现透明水解圈。根据透明圈出现的早晚、透明圈直径与菌落直径比值（R值）的大小筛选获得活性高且产酶周期短的菌株。将菌株接种于筛选培养基上保存备用。

1.2.2 菌体16S rDNA序列测定与分析 将菌株接种于液体培养基中，20 ℃培养2 d，离心收集菌体，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取其DNA。采用16S rDNA的通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACGGCTACCTT GTTACGACTT-3′）进行PCR扩增。PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司完成测序工作。将测序结果在GenBank中进行序列同源性分析，并利用Mega 5.2软件进行系统发育树的构建。

1.2.3 菌体粗酶液酶学特性的研究 从筛选培养基上挑取少许菌种，接种于装有25 mL发酵培养基的100 mL三角瓶中，20 ℃静置培养2 d。4 ℃、16 000 g离心5 min，收集上清，即得到粗酶液。

（1）粗酶酶活性的测定。酶解底物为去淀粉麦麸（DSWB），制备方法参见文献[8]。取上述250 μL粗酶液于离心管中，并加入750 μL磷酸缓冲液（100 mmol/L，pH值 7.0），45 ℃恒温水浴保温5 min。随后加入10 mg DSWB反应60 min，沸水浴5 min后终止反应，通过高效液相色谱（HPLC）检测酶反应液中阿魏酸的含量。在上述反应条件下，1 min产生1 μg阿魏酸所需的酶量定义为1个酶活性单位（U）。

HPLC的检测条件如下：Inertsil C8-3色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-1%冰醋酸（体积比 30 ∶ 70）；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；检测波长320 nm；进样量20 μL。

（2）粗酶的最适温度与温度稳定性。分别用不同温度（30～70 ℃）代替上述酶反应体系中反应温度，测定粗酶液在各温度下的酶活性。以最高酶活性为100%，计算相对酶活性。将粗酶液置于不同温度（45～80 ℃）下，恒温水浴处理 2 h，每个温度设3个重复，测定残余酶活性。

（3）粗酶的最适pH值与pH值稳定性。使用柠檬酸钠缓冲液（50 mmol/L，pH值5.0），50 mmol/L pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.4、8.0的磷酸缓冲液和甘氨酸-NaOH缓冲液（50 mmol/L，pH值9.0、10.0）代替上述酶反应体系中使用的缓冲液，测定在各pH值下的酶活性。设最高酶活性为100%，计算相对酶活性。将粗酶液置于不同缓冲液（pH值5.0～10.0）中，45 ℃保溫2 h，每个pH值设3个重复，测定残余酶活性。

1.2.4 菌体粗酶液对木质纤维素材料的降解 通过在上述酶反应体系中添加10 U木聚糖酶后测定阿魏酸释放量提高与否检测粗酶与木聚糖酶的协同关系。分别使用250 μL FAES1和混合酶液（250 μL FAES1、10 U木聚糖酶）作用于10 mg DSWB、10 mg汽爆小麦秸秆（SEWS）、10 mg汽爆玉米秸秆（SECS）6 h后，每个组合设3次重复，测定阿魏酸的释放量。SEWS、SECS采用曾薇等的方法[9]进行制备。上述植物纤维材料中阿魏酸的含量可以采用Mukherjee等的方法[10]进行测定。

2 结果与分析

2.1 产阿魏酸酯酶菌株S1的筛选

利用平板透明圈法，从海水中筛选到3株具有阿魏酸酯酶活性的菌株。由表1、图1可知，菌株S1出现阿魏酸酯酶活性最早，且透明圈直径最大。透明圈出现的早晚与产酶周期、R值与酶活性呈正相关，由此说明菌株S1产酶周期短，且阿魏酸酯酶活性较高。

2.2 产阿魏酸酯酶菌株S1的鉴定

2.2.1 菌株形态结构观察 菌株S1在固体培养基中于 20 ℃ 培养2 d后，直径为2～3 mm，菌落为白色，且长入培养基内部，表面干燥、粗糙，边缘不规则，与培养基结合紧密，不易挑起（图1）。在液体培养基中，S1呈颗粒状附着于甁壁，不使培养基变浑浊（图2-a）。该菌在普通细菌营养培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基、LB培养基）中不生长。通过显微观察发现，S1细胞呈球状（图2-b），革兰氏阴性。

2.2.2 16S rDNA扩增及分析 通过PCR扩增获得菌株S1的16S rDNA片段的电泳结果如图3所示。经测序，此16S rDNA序列长1 437 bp，提交至NCBI GenBank，注册号为KT721290。将该序列提交至GenBank进行同源序列比对，结果显示，在检索到的100个相似性较高的16S rDNA序列中，有39个为甲基营养菌种属，1个为氨基营养菌种属，其余为不可培养微生物。其中，菌株S1与鞭毛甲基小杆菌（Methylobacillus flagellatus）的同源性最高，高达97%。以16S rDNA序列同源性为基础，使用Mega 5.2的邻接（Neighbor-Joining） 分析法经过1 000次置换式取样计算出 Bootstrap值生成系统进化树，结果见图4。结合该菌的形态特征，推测该菌属于嗜甲基菌科。

2.3 粗酶FAES1酶学特性研究

2.3.1 粗酶酶活性 以DSWB为底物检测粗酶的酶活性，结果表明，该粗酶的酶活性为（2.81±0.35）U/mL。

2.3.2 粗酶的最适作用温度和热稳定性 FAES1在45 ℃时酶活性最高，在40～60 ℃时相对酶活性保持在70%以上，高于60 ℃或低于40 ℃时酶活性呈下降趋势。由图5可见，当粗酶液于70 ℃保温2 h后，残余酶活性可维持80%以上；当温度上升至75 ℃时，粗酶液保育2 h后仍可保存45%左右的酶活性。由此可见，FAES1具有明显的热稳定性，从而使其在高温工业流程（如制浆过程）中具有应用潜力。

2.3.3 粗酶的最适作用pH值和pH值稳定性 由图6可知，FAES1的最适pH值为7.0。在pH值6.0～9.0的范围内，粗酶表现出良好的稳定性，残余酶活性可维持80%以上。

2.4 粗酶FAES1与木聚糖酶对木质纤维素材料的协同作用

通过在反应体系中添加木聚糖酶与否检验FAES1与木聚糖酶的协同作用。经测定，当FAES1单独作用于10 mg DSWB、10 mg SEWS、10 mg SECS 6 h时，可以释放阿魏酸的量分别约占各种材料中总阿魏酸含量的37.0%、16.5%、79%；当使用混合酶液（含FAES1与木聚糖酶）作用同样时间，阿魏酸释放量分别约占总含量的46.0%、33.2%、141%，均高于单独使用FAES1，其中以对DSWB的降解能力最强（表2）。

3 讨论与结论

本研究通过平板透明圈法从海水中获得1株产阿魏酸酯酶菌株S1，通过其培养特征、形态特征和分子生物学鉴定，初步推测其属于嗜甲基菌科，这是首次发现此科菌株具备阿魏酸酯酶活性，为生产阿魏酸酯酶的微生物新成员。

经过初步酶学性质研究发现，菌株S1所生产的阿魏酸酯酶FAES1在70 ℃下仍保持较高酶活性，与腾冲嗜热厌氧菌（Thermoanaerobacter tengcongensis）来源的阿魏酸酯酶TtFAE[11]相似。莱州湾南岸海域年平均水温11～12 ℃[12]，并不属于高温海域，然而源于菌株S1的阿魏酸酯酶FAES1却具有显著的热稳定性。已报道的阿魏酸酯酶Est27[13]、纤维素酶Cel5A[14]表现出与其非极端环境的来源不相关的良好的耐盐性。此现象的出现可能由于非极端环境承受更大温度、盐度、pH值的变化波动，那么处于非极端环境的生物酶需要适应这些波动而发挥其生物活性[11]。FAES1所具有的显著热稳定性使其具备工业应用的潜力。

FAES1对麦麸、小麦秸秆、玉米秸秆均表现出降解能力，显示其较广的天然底物范围，其中以对麦麸的作用能力最强。与StFaeC（Sporotrichum thermophile）[15]、AusfaeA（Aspergillus usamii）[16]相似，FAES1单独作用于DSWB时能够释放阿魏酸，且能够释放出高达37%的阿魏酸，远高于上述阿魏酸酯酶（单独使用StFaeC、AusfaeA分别可释放DSWB中3.7%、19.48% 阿魏酸），表现出较高的酶活性。木聚糖酶的加入可以提高阿魏酸的释放量，说明阿魏酸酯酶在木质纤维素降解过程中与木聚糖酶具有良好的协同关系[13]。阿魏酸以其抗氧化、防自由基、抗血栓、降血脂、抗癌、抗辐射等功能著称[17]，可用作功能性食品、化妆品的添加剂，广泛存在于麦麸中。FAES1与木聚糖酶的协同作用能够释放DSWB中高达46%的阿魏酸，显示FAES1在提高麦麸价值方面极具应用潜力。

上述试验结果显示，海洋环境中确实蕴藏着丰富且新颖的阿魏酸酯酶，可利用宏基因组技术开发更多的海洋阿魏酸酯酶资源。后续研究将进一步确定FAES1的类型，并围绕菌株S1产酶条件的优化、FAES1的纯化、阿魏酸酯酶基因克隆与表达等方面展开工作，以期提高阿魏酸酯酶FAES1的活性，深入挖掘其应用价值。

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