具有除草活性的生防菌株GD-9发酵条件优化及菌剂制备

材料与方法

1.1 材料

供试菌株：GD9是分离自大刺儿菜根系土壤中的一株放线菌，保存于青海省农林科学院植物保护研究所有害生物综合防治实验室。

高氏一号培养基：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、琼脂16～18 g、蒸馏水1 L、pH 7.4～7.6。

高氏一号液体培养基：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、蒸馏水1 L、pH 7.4～7.6。

碳源：可溶性淀粉、麦麸、蔗糖、葡萄糖、玉米粉、小麦粉。

氮源：大豆粉、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸钠、硫酸铵、尿素。

固态发酵基质：羊粪、菜籽饼、小麦秸秆、麦麸、玉米粉。

载体及助剂：可溶性淀粉、CaCO3、糊精、羧甲基纤维素、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、拉开粉、十二烷基硫酸钠、木质素磺酸钠、白炭黑、膨润土、轻质碳酸钙、聚乙烯醇、腐殖酸、硅藻土、吐温、沙子、黏土、炉渣。

1.2 菌株活化

制备高氏一号培养基，倒平板使其冷却、凝固待用;从冰箱中取出4℃条件下保存的菌株，使其恢复到室温状态， 用接种针挑取适量菌丝在高氏培养基上划线，之后放入28℃培养箱黑暗培养7 d，挑取其中部分菌丝接种到新的培养基中培养，重复此步骤2～3次，从而得到生长良好的菌落（图1）。

1.3 最适碳、氮源的筛选

用高氏1號为基础培养基进行碳源筛选试验，将可溶性淀粉、麦麸、蔗糖、葡萄糖、玉米粉、小麦粉作为碳源，按质量分数2%的量加入高氏1号培养基中，搅拌均匀，121℃高压灭菌30 min，在超净工作台中倒入灭菌的培养皿中待其冷却凝固，将活化后生长旺盛的菌落打8 mm菌饼， 菌丝面朝下接种于培养基中央，放入28℃恒温培养箱黑暗培养，定期测量菌落直径和孢子悬浮液的OD值。以不添加碳源的培养基为对照组，选出菌落生长好的碳源。每组设置3个重复。

用高氏1号为基础培养基进行氮源筛选试验，将大豆粉、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸钠、硫酸铵、尿素作为氮源，按2%的量加入高氏1号培养基中，用不添加氮源的培养基作为对照组，以同样的方法选出菌落生长好的氮源。每组设置3个重复。

孢子悬浮液OD值测定：用载玻片将菌落上的孢子轻轻刮下，加入5 mL超纯水，用单层干净无菌纱布过滤除去菌丝，得到孢子悬浮液。用分光光度计在600 nm波长下测其OD值，选出产孢量最佳的碳源[12]。以同样的方法，选出产孢量最高的氮源。

1.4 固态发酵基质筛选

选用菜籽饼、玉米粉、羊粪、麦麸和小麦秸秆等价格低廉的农副产品下脚料作为固态发酵基质。每瓶中小麦秸秆10 g、羊粪15 g、菜籽饼25 g、玉米粉 25 g、麦麸25 g分别放入150 mL的三角瓶中，按质量分数2%的量加入所筛选出来的最适碳氮源、适量的自来水，充分搅拌均匀，经121℃、30 min高温高压灭菌后，冷却到室温。在超净工作台里每瓶接种菌液5 mL后在28℃恒温培养箱进行培养，观察记录菌落生长状况，以不接菌液的固态基质为空白对照;用分光光度计测定经过滤的菌悬液OD值，筛选出产孢量高的固态发酵基质。每组设置3个重复。

1.5 正交试验优化培养条件

采用L25（57）正交表，测定碳源、氮源、初始含水量、接种量、初始pH、培养时间、培养温度7个因素对菌株GD9活菌数的影响，每种因素各取5个水平（表1），对菌株GD9固态发酵条件相关上述7个因素进行正交设计得到49个处理（表2）。根据最适碳氮源和固态发酵基质的筛选结果，选用麦麸∶羊粪=1∶1作为固态发酵基质，葡萄糖作为碳源，硝酸钠作为氮源，根据配方配制不同处理的固态发酵培养基，经121℃灭菌30 min，冷却到室温后，依次接入GD9发酵液，搅拌均匀，置于生化培养箱中28℃静置培养。不同处理自然风干、粉碎，平板菌落计数法测定不同处理的活菌数。每个处理设3次重复。

1.6 载体筛选及剂型制备

用高氏1号为基础培养基进行载体单因素试验，将初筛出来的载体硅藻土、膨润土、拉开粉、白炭黑及助剂羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、木质素磺酸钠等按质量分数2%的量加入高氏1号培养基中，搅拌均匀，121℃高压灭菌30 min，在超净工作台中将含不同载体或助剂的培养基倒入灭菌的培养皿中，待其冷却凝固，将活化后生长旺盛的菌落打8 mm菌饼， 菌丝面朝下接种于培养基中央，放入28℃恒温培养箱黑暗培养，定期测量菌落直径和孢子悬浮液OD值。以不添加载体的基质为对照组，选出菌落生长好的载体。每组设置2个重复。根据前几步所筛选的最适碳氮源、固态发酵基质及正交试验优化的最佳培养条件进行菌剂的研制。在最适固态发酵基质中加适量的水、2%的碳氮源，121℃、30 min高温高压灭菌后，冷却到室温。每个白盆0.7 kg基质，接种菌液160 mL，用手搅拌均匀后用保鲜膜封口室温培养。

1.7 数据分析

全部数据分析在DPS 6.50 数理统计分析软件上进行。

2 结果与分析

2.1 最适碳氮源筛选

分别于培养第5、7 和9天测定菌株GD9在不同碳氮源培养基上的菌落直径和孢子悬浮液OD值，结果见表3、表4。GD9在葡萄糖培养基上菌落生长最快，菌落直径最大，葡萄糖培养基与其他碳源处理孢子悬浮液OD值之间存在极显著性差异，在可溶性淀粉和麦麸培养基上菌落直径略小，在小麦粉培养基上最小。在硝酸钠培养基上菌落直径最大，且与其他氮源处理孢子悬浮液OD值之间存在极显著性差异;尿素培养基完全抑制菌落生长。结合菌落形态、菌落直径和孢子悬浮液OD值，最终筛选最适碳源为葡萄糖，最适氮源为硝酸钠。

2.2 固态发酵基质筛选

利用孢子悬浮液分光光度值判断不同固态基质的产孢量大小。从表5可以看出，菌株GD9生长较好的固态基质为：羊粪>麦麸>菜籽饼>小麦秸秆>玉米粉;孢子悬浮液OD值方差分析结果表明，羊粪培养基上GD9产孢量与其他基质间存在极显著差异，菜籽饼、玉米粉、麦麸和小麦秸秆之间不存在显著性差异。因此，GD9菌株的最适产孢固态发酵基质为羊粪。

2.3 正交试验优化培养条件

菌株GD9固态发酵的正交试验统计结果（表6）表明，试验的7种因素中极差R值从大到小依次为：氮源（4.72）、碳源（3.69）、初始含水量（3.51）、培养温度（3.48）、接种量（2.85）、初始pH（2.59）、培养时间（2.56）。因此，影响菌株GD9固态发酵条件的因素作用由大到小依次为：氮源>碳源>初始含水量>培养温度>接种量>初始pH>培养时间。从各水平的统计A值比较来看，菌株GD9的最佳固态发酵条件为：氮源硝酸钠58.4 mg/g、碳源葡萄糖48.4 mg/g、初始含水量258 mg/g、接种量0.26 mL/g、初始 pH 7.6、培养时间147.8 h、培养温度30.7℃。

2.4 载体及助剂筛选

表7可以看出：黏土培养基上菌落生长最快，菌落直径最大，且黏土培养基上得到的孢子悬浮液OD值最高，与其他载体培养基的孢子悬浮液OD值之间存在极显著差异，膨润土、聚乙烯醇及糊精处理的次之;拉开粉和海藻酸钠载体处理的孢子悬浮液间不存在显著差异，完全抑制菌丝生长，菌落直径为8.0 mm，孢子悬浮液OD值为0。其余载体处理孢子悬浮液OD值之间均存在极显著差异。

综合菌落形态、菌落直径和孢子悬浮液OD值得出，菌株GD9最适载体和助剂为黏土、膨润土、聚乙烯醇、糊精。

2.5 剂型研制

根据所筛选的最适碳氮源、固态发酵基质及正交试验优化的最佳培养条件进行菌剂的研制。在羊粪∶麦麸=1∶1的固态发酵基质中按质量分数加25.8%水、2%碳氮源（葡萄糖、硝酸钠），121℃、30 min高温高压灭菌后，冷却到室温。每个白盆0.7 kg基质，接种菌液160 mL，搅拌均匀后用保鲜膜封口室温培养。

将GD9菌剂按质量分数60%、黏土30%、膨润土1%、糊精3%、聚乙烯醇6%的比例混合，按照一定的工艺，初步试验探索得到稳定性强、可均匀分散的易溶于水的可湿性粉剂。

3 结论与讨论

本试验通过对具有除草活性的菌株GD9的活化，最适碳氮源、固态发酵基质、载体的筛选以及采用正交试验优化培养条件。得出以下结论：

以菌落直径和孢子悬浮液OD值为指标筛选最适碳氮源以及载体和助剂，筛选出最适碳源为葡萄糖，最适氮源为硝酸钠，最适载体及助剂为黏土、聚乙烯醇、膨润土、糊精。

用菌落计数法和孢子悬浮液OD值测定法对最适固态发酵基质和最优培养条件的筛选中，筛选出最适固态发酵基质为羊粪;影响菌株GD9固态发酵条件的因素作用由大到小依次为：氮源>碳源>初始含水量>培养温度>接种量>初始pH>培养时间。菌株GD9的最佳固态发酵条件为：氮源硝酸钠58.4 mg/g、碳源葡萄糖48.4 mg/g、初始含水量258 mg/g、接种量0.26 mL/g、初始pH7.6、培养时间147.8 h、培养温度30.7℃。

生防菌固态发酵基质的选取一般都是容易获得、价格低廉的农副产品下脚料，在农业生产上既绿色、无公害，又可保護环境，符合农业可持续发展的要求[14]。本研究中生防菌株GD9的固态发酵适用于大批量生产，得到的菌剂易保存，方便储存和运输。

微生物除草剂的开发应用比化学农药的开发存在更大的难度，其药效受外界环境影响很大，所以选择合适的载体助剂是生物农药开发的关键。生物农药助剂的功能，就在于改善农药的一些物理或化学性能，最大限度地发挥药效及安全施药[15]。

本试验已筛选出了最适合的载体及助剂，后续试验可将GD9菌剂60%、黏土30%、膨润土1%、糊精3%、聚乙烯醇6%的比例进行混合，按照一定的工艺，初步试验探索得到稳定性强、可均匀分散的易溶于水的可湿性粉剂。最终筛选研制出防除效果较好的除草剂剂型，为微生物除草剂的研究提供理论依据。

参考文献

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（责任编辑：田 喆）

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