双孢蘑菇酶解液的制备及GC—MS分析

摘要：采用碱性蛋白酶、纤维素酶和碱性蛋白酶复合纤维素酶对新鲜双孢蘑菇子实体进行水解，设计L9（34）正交试验考查温度、pH值、酶添加量和时间对蛋白水解度的影响，制备蛋白水解度最高的酶解液，利用GC-MS对其中的挥发性物质进行分析。结果表明，纤维素酶最佳酶解参数为温度50 ℃，pH值5.0，酶添加量0.8%，时间120 min；碱性蛋白酶最佳酶解参数为温度40 ℃，pH值10.5，酶添加量0.9%，时间150 min。用碱性蛋白酶复合纤维素酶水解双孢菇后，水解度达20.80%，共有33种挥发性成分。

关键词：双孢蘑菇；碱性蛋白酶；纤维素酶；GC-MS

中图分类号：TS264 文献标志码：A doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2018.09.034

Abstract：The fruit body of Agaricus bisporus was hydrolyzed by enzyme，and the effect of temperature，pH value，enzyme dosage and time on the degree of proteolysis were investigated by L9（34） orthogonal experiment. The volatile components of the hydrolyzate were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）. The results showed that the optimum enzymatic hydrolysis parameters of cellulase was the temperature 50 ℃，pH 5.0，the amount of enzyme 0.8%，time 120 min. The best enzymolysis parameters of alkaline protease was the temperature 40 ℃，pH 10.5，the amount of enzyme 0.9% and the time 150 min. Using alkaline protease and cellulose hydrolyze the fruit body of Agaricus bisporus，the degree of hydrolysis was 20.80%，33 kinds of volatile components were identified.

Key words：Agaricus bisporus；alkaline protease；cellulase；GC-MS

国内外研究表明，酶法水解可以改善食品的营养吸收特性及风味[1-3]。目前，食用菌酶法水解的研究多集中在蛋白质、多糖、黄酮和水溶性膳食纤维的提取及抗氧化等功能性质和相关产品开发方面[4-7]，对酶法水解后食药用菌的风味特征和挥发性成分研究较少。双孢蘑菇（Agaricus bisporus）因其风味独特、营养丰富而在全球范围均有种植和消费[8]，在加工过程中风味会迅速改变。热加工过程中，双孢蘑菇中醇的含量显著降低，而酮和酸的含量则明显增加[9]。单纯煮沸的双孢蘑菇汤中挥发性成分的数量显著高于煮沸加蒸压蘑菇汤中的挥发性成分[10]。冷冻干燥、热风干燥和微波真空干燥的加工方式对双孢蘑菇的挥发性成分的影响与热加工方式一致。双孢蘑菇子实体酶解液中挥发性风味物质的研究较少。

为探讨新鲜的双孢蘑菇子实体酶解液中的挥发性风味成分，试验采用碱性蛋白酶（Alkaline protease）、纤维素酶（Cellulase）、碱性蛋白酶复合纤维素酶对新鲜双孢蘑菇子实体进行水解。设计L9（34） 正交试验考查温度（A）、pH值（B）、酶添加量（C）和时间（D）对双孢蘑菇蛋白水解度（DH）的影响。利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）对双孢蘑菇蛋白水解度最高的酶解液中挥发性成分进行分析。为研究双孢菇酶解后特有风味的形成机理和功能提供依據。

1 材料与方法

1.1 材料

双孢蘑菇，山西鼎昌农业科技有限公司提供；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 双孢蘑菇预处理

选择新鲜白色、没有腐烂变质和严重褐变的双孢蘑菇，切块，浸于护色液（0.6%柠檬酸+ 0.3%氯化钠+ 0.05%抗坏血酸）中约30 min。料液比为1∶2，匀浆机打浆备用。

1.2.2 Cellulase水解双孢蘑菇参数的筛选

Cellulase正交试验因素与水平设计见表1。

按照表1所列的四因素三水平对双孢蘑菇处理，处理完成后将双孢蘑菇样液取出，加入50 mL蒸馏水，摇匀后缓缓加入Zn（CH3COO）2溶液5 mL和K4Fe（CN）6·3H2O溶液5 mL，然后定容至100 mL，静置，以转速3 000 r/min离心10 min，取上清液。计算还原糖的含量[11]。

1.2.3 Alkaline protease酶解双孢蘑菇参数的筛选

Alkaline protease正交试验因素与水平设计见表2。

按照表2所示对双孢蘑菇处理，处理完成后，记录室温下恢复至原始pH值所消耗0.1 mol/LNaOH的体积，并计算DH[12]。

1.2.4 Alkaline protease复合Cellulase对双孢蘑菇的酶解

在上述1.2.3测得的条件下，先用Alkaline protease水解双孢蘑菇子实体，再在1.2.2测得的条件下，用Cellulase水解，测定最终酶解液的DH。与1.2.3测得的DH相比，取DH大的酶解产物进行GC-MS分析。

1.2.5 GC-MS试验条件

根据参考文献[13]进行试验条件的设置，对部分条件进一步改进：色谱柱为DMNI-MS型毛细管柱（30 m×250 μm 0.25 μm）；柱温45 ℃，保持2 min，以6 ℃/min上升至240 ℃，保持5 min。进样口温度270 ℃，流速1 mL/min，无分流。离子源温度280 ℃，扫描质量范围35～600。

2 结果与分析

2.1 Cellulase水解雙孢蘑菇最佳参数的确定

Cellulase水解双孢蘑菇的正交试验结果见表3。

由表3可知，还原糖含量最高的组合为A2B2C3D1，各个因素对双孢蘑菇酶解后还原糖含量的影响依次为B>C>D>A。测得各因素的最优水平组合A1B2C3D2条件下，双孢菇的酶解液中还原糖含量为2.04%，高于A2B2C3D1。因此，Cellulase水解双孢菇的最佳参数确定为A1B2C3D2，即酶解温度50 ℃，pH值5.0，酶添加量0.8%，时间120 min。

2.2 Alkaline proteas水解双孢蘑菇最佳参数确定

研究表明，以DH作为评价指标时，Alkaline proteas是从5种不同的蛋白酶中筛选出来的水解双孢蘑菇的最佳蛋白酶[14]，因此选用Alkaline proteas。

Alkaline protease酶解双孢蘑菇的正交试验结果见表4。

由表4可知，DH最高的处理组合为A"2B "3C "1D "3，各因素对双孢蘑菇的水解液中DH的影响依次为B "> C ">D ">A"。测得因素的最优水平组合A"2B "3C "2D "3条件下双孢蘑菇酶解液DH均值为18.27%，高于A"2B "3C "1D "3。因此，最佳方案确定为温度40 ℃，pH 值10.5，酶添加量0.9%，时间150 min。

2.3 Alkaline proteas复合Cellulase水解双孢蘑菇结果

在上述筛选出的最佳条件下，用Alkaline proteas复合Cellulase酶解双孢蘑菇，做3次重复，测得DH分别为21.30%，20.98%，20.12%。将该结果与双孢蘑菇Alkaline proteas酶解液的DH进行方差分析。

方差分析见表5。

由表5可知，F值为31.5，大于方差分析表中F0.05 （1，4）=7.71，F0.01 （1，4）=21.20，差异极显著。因此，选择双孢蘑菇复合酶水解双孢蘑菇的酶解液进行GC-MS分析。

2.4 双孢蘑菇酶解产物挥发性成分的GC-MS分析

双孢菇酶解产物挥发性成分的GC-MS见图1，双孢蘑菇酶解产物挥发性化合物组成及其含量见表6，酶解后的双孢蘑菇中挥发性化合物的种类及相对含量见表7。

通过GC-MS测得双孢蘑菇水解产物中的挥发性成分33种，总的相对含量为77.81%，其组成和含量列于表6中，其中的1 -辛烯- 3 -醇的相对含量最高为33.37%，其次为苄醇13.67%，苯甲醛11.38%，3 -辛酮4.91%，均为C8类化合物，结果与其他食用菌香味的报道一致。不管是新鲜双孢菇，还是煮沸、干燥或水解后的双孢菇，C8化合物对其鲜味影响最大。将表6中的化合物进行分类整理，结果如表7所示，双孢蘑菇酶解液中醛类物质种类最多，有10种，相对含量为20.50%；醇类物质的种类有 8种，但其相对含量为49.86%，最高。其次为酮类物质，共6种。还含有少量的烷烃、烯烃、苯类、含氮化合物等。此外，酶解后的双孢蘑菇中还含有 2种吡嗪类化合物，相对含量0.27%，与美拉德反应有关，热加工和干燥处理没有检测到该物质。酶解后，醛酮类挥发性物质的种类增加，酯类物质的种类减少可能是由于新鲜双孢菇子实体中的酸类和酯类物质在酶解条件下降解成醛酮类物质。

3 结论

纤维素酶水解双孢菇子实体的最佳参数为温度50 ℃，pH 值5.0，酶添加量0.8%，时间120 min；碱性蛋白酶水解双孢菇子实体的最佳条件为温度40 ℃，pH值10.5，酶添加量0.9%，时间150 min。用复合酶水解双孢菇子实体后，DH为20.80%，其中有33种挥发性化合物。

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