酶底物法和多管发酵法检测水中的总大肠菌群的比较研究

总结报告如下。

1 材料与方法

1.1 样品

大英县农村饮用水22份。

1.2 试剂

酶底物法由株洲鸿润检测技术有限公司提供的总大肠菌群-大肠埃希氏菌测定试剂盒，十管法，批号为20150416。 多管发酵法的乳糖培养基由杭州滨和微生物试剂有限公司提供，批号为20150822，EC肉汤由北京奥博星生物技术有限责任公司提供，批号为20141222，伊红美蓝琼脂由北京奥博星生物技术有限责任公司提供，批号为20141222。

1.3 原理

酶底物法是利用大肠菌群可产生β-半乳糖苷酶，该酶能分解试剂盒中底物邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），而生成黄色的邻-硝基酚，使培养基呈现颜色变化，颜色会从无色变成黄色，指示有大肠菌群的存在；而大肠埃希氏菌可产生β-葡萄糖醛酸酶，而β-葡萄糖醛酸酶能对试剂中的4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）成份进行代谢，使其产生荧光，可在紫外灯下进行鉴别。多管发酵法是根据大肠菌群能发酵乳糖，产酸产气及具备革兰氏染色阴性，无芽孢呈杆状等有关特性的菌群组。

1.4 方法

每份水样分成两份接种以下两种方法，根据污染程度进行稀释。

1.4.1 酶底物法 采用十管法，直接将水样100 mL加入含有“科立德”酶底物试剂的无菌瓶中，盖上瓶盖，颠倒混匀，使酶底物试剂充分溶解，加样：使用10 mL无菌刻度吸管吸取上述处理好的水样10 mL加入到试剂盒的方格中，共十格，盖上盖子（36±1）℃，培养24 h后进行判读，如果结果可疑，可延长培养时间到28 h进行结果判读，查MPN检索表报告水样中的MPN值。

1.4.2 多管发酵法 应先接种水样到乳糖蛋白胨培养基，于（36±1）℃培养箱内培养（24±1）h，如所有培养管均不产气，则可报告为总大肠菌群阴性；如有产酸产气者，则需要转种于伊红美兰平板，对可疑菌落进行革兰氏染色、镜检和证实实验。根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表报告水样中的MPN值[2]。

1.5 统计方法

按假设检验分析整理统计数据。

2 结果

采用酶底物法和多管发酵法测定水样中的总大肠菌群的结果详见下表。

通过多管法和酶底物法对22份水样检查结果进行比较，对于同一受试对象分别接受2种不同处理方法采用配对t检验分析，计算结果：则t=1.640，P>0.05，两者差异无统计学意义。

3 讨论

管发酵法（GB/T5750-2006）。在目前生活饮用水检测工作中绝大多数的还采用经典的。究其原因是多管发酵法稳定性好，结果容易判断，物资成本低。但从本组实验过程中不难发现，多管发酵法很多是使用的半成品培养基，经实验室自行配制后再用于样品的检测，要经过一系列准备工作才能用于检测，任何一个环节的误差都会给检测结果带来影响。如：原材料的质量，试剂称量的准确性和高压消毒的参数等诸多因素均会对最终结果造成影响。在实验过程中还需要转种，验证试验，实验步骤较为繁琐，程序越多引入的误差可能性越大，结果的可靠性也就越小；加之许多实验室没有条件按照国标用质控菌株对培养基进行性能评价实验，导致产品质量的最后把关环节存在一定风险。这就将一些不确定性因素引入到了检测过程中，难以保证检测结果的准确性。检测时间相对较长，需要2～5 d，更不能对水质的卫生状况做出快速评价也是制约工作的缺陷。

酶底物法因技术要求高、检测费用高等原因致该法应用少。作者通过实践证实具有人力成本较低，步骤简便，结果产生快，容易判断，稳定性也好等优点。试剂盒是在全程质量控制下，按照国标要求配制，消毒并用质控菌株进行性能评价实验；其操作方便无需确证实验，此法还可监测大肠埃希氏菌，该菌更有病原学意义；酶底物法稳定，无二次污染，检测时间较短，18～24 h即可出结果，判断出大肠菌群和大肠埃希氏菌的MPN值；试剂盒占空间体积较小，受影响因素小，又特别适合大批量和应急检测的需求。值得推广应用。

该组对照实验表明，相对于多管发酵法，酶底物法用于测定水样中的总大肠菌群具有高度的一致性（P>0.05），两者差异无统计学意义。有实验者发现酶底物法可以同时检测总大肠菌群和大肠埃希氏菌。大量研究资料证实：大肠埃希氏菌与肠道传染病（如腹泻），消化系统疾病（如胃溃疡）等有密切的关系[3-4]，因此监测水中含大肠埃希氏菌的多少更有利于说明水质的安全状况。近年来，我国《生活饮用水卫生标准》与世界接轨，已经增加大肠埃希氏菌的检测作为评价饮用水水质的指标。通过检索表的对比可发现由于多管发酵法每100 mL水样中最低检出限为2个大肠菌群，而酶底物法每100 mL水样中最低检出限为1个大肠菌群，酶底物法在肠杆菌属的检出灵敏度上显著高于多管发酵法，显然酶底物法更适合大肠菌群较低的水样；而在埃希氏菌属的检出灵敏度基本一致[5-7]。

4 结语

通过以上实验证明：酶底法和多管发酵法对生活饮用水中总大肠菌群的检测结果具有一致性，这和孙宗科，赵春霞等的研究结果相同[6-7]。随着社会发展对检测结果的快速准确要求，国家对实验室的投入及实验室的自身发展，加之国产酶底物试剂的质量逐步优化，与进口试剂等效[8]，检测成本也将不断降低，酶底物法对大肠菌群的检测是个必然趋势。由于基层实验室的实验人员的配备不够，节省人力成本，步骤简便的酶底物法特别适合在基层实验室推广应用。

[参考文献]

[1] Yakub GP， Castric DA ， Stadterman-Knauer KL， et al.Evaluation of coliert and enterolert defined substrate methodology for wastewater application[J].Water Environ Res，2002，74（2）：131-135.

[2] 卫生部.GB/T5750.12-2006生活饮用水标准检验方法[D].微生物指标，北京：中国标准出版社，2006.

[3] USEPA.Standard methods for the examination of water and wastewater 20th edition [M].

[4] USEPA.Ambient Water Quality Criteria for Bacteria.[S].1986.

[5] 王晋宇，赵旭坤，郭志宇，等.酶底物法与多管发酵法检测总大肠菌群差异分析[J].中国给排水，2012，28（20）：139-141.

[6] 孙宗科，丁培，薛金荣，等.水中大肠菌群快速检测方法-酶底物与多管发酵法的比较[J].卫生研究，2006，35（4）：497-498.

[7] 赵春霞，张哲海，历以强，等.酶底物法与多管发酵法和纸片法监测环境水样大肠菌群的比较[J].环境监测管理与技术，2009，21（2）：63-64.

[8] 陈艳宏，马健，权玉玲.2种试剂的酶底物法和多管发酵法检测水中总大肠菌群的比较研究[J].中国卫生检验杂质，2014，24（22）：3257-3261.

（收稿日期：2016-03-27）

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