混菌固态发酵菜籽粕生产饲用复合酶发酵条件研究

材料与方法

1.1 材料与仪器

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），毛霉（Mucor），黑曲霉（Aspergillus niger），酵母菌（S.cerevisiae），购于中国微生物菌种保藏中心，由本院生物制药国家重点实训基地保藏。

斜面培养基：PDA培养基：马铃薯（去皮）20%，葡萄糖：2%，琼脂：2%;牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏;0.3%，蛋白胨：1%，NaCl：0.5%，琼脂：2%。

发酵培养基：脱毒菜饼50g，0.1%CaCl2，1.5%NH4Cl，2%K2HPO4，0.2%MgSO4，0.5%MnSO4，1%Tween-80，混匀备用。

CBV-1500A超净工作台（上海瑞仰净化装备有限公司）;QYC.2102恒温培养摇床（上海福玛实验设备有限公司）;HPS-250生化培养箱（哈尔滨东明医疗仪器厂）;LDZ4-0.8A离心机（北京医用离心机厂）;UV-9100紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）;HH.SYH-Ni2-C水浴锅（北京长源实验设备厂）。

1.2 实验方法

1.2.1 菜籽粕的预处理

利用乙醇法脱毒[10]，脱除有毒物质硫甙等物质，达到脱毒目的。

1.2.2 混菌的选择

装50g菜籽粕发酵培养基于250mL摇瓶中，分别按不同组合和比例接入枯草芽孢杆菌、毛霉、酵母菌、黑曲霉4种菌种，于温度为36℃、转速为200转/分的摇床上发酵培养3d，测定蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶三种酶的总酶活，以选擇出混菌发酵的菌种组合。

1.2.3 粗酶液制备

取发酵产物10g，溶于50mL水中，置于4000r/min的离心机上离心分离15min，取上清液经8层纱布过滤所得澄清液体即为粗酶液。

1.2.4 蛋白酶活力测定

按GB/T23527-2009进行[11]。酶活力单位定义：在pH7.0、40℃条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量为1个蛋白酶活力单位（U）。

1.2.5 淀粉酶活力测定

采用DNS法[12]进行测定。淀粉酶活力单位定义：在pH5.5、50℃条件下，1min分解淀粉释放出1μg还原糖所需的酶量为1个蛋白酶活力单位（U）。

1.2.6 纤维素酶活力测定

采用DNS法[13]进行测定。纤维素酶活力单位定义：在50℃条件下，在1min内酶解生成1μg还原糖的酶量为1U。

1.2.7 饲用复合酶总活力

其计算公式如下：

饲用复合酶总活力=蛋白酶活力+淀粉酶活力+纤维素酶活力

1.2.8 单因素实验设计

分别以发酵温度、发酵时间、转速、接种量为单因素进行实验，探讨各因素对饲用复合酶总酶活的影响。发酵温度分别为32、34、36、38、40℃，发酵时间分别为24、36、48、60、72h，转速分别为160、180、200、220、240r/min，接种量2%、4%、6%、8%、10%。

1.2.9 响应面分析

在单因素实验基础上，按Box-Behnken实验设计原理，选取温度、转速、接种量进行三因素三水平中心组合实验，见表1。利用mintab15软件进行分析，确定最佳发酵条件。

2 结果与分析

2.1 不同混菌组合发酵结果

按实验方法，将供试菌种按1：1比例两两组合，或三者组合混菌发酵72h，测定饲用复合酶总酶活，得到结果如表2所示。

从表2结果可知，在混菌组合中，相对于其他组合来讲B+M+S的饲用复合酶总酶活最高，达到5594U/g，表现出良好的协同性。因此最佳组合为枯草芽孢杆菌、毛霉、酵母菌（1：1：1）。

2.2 單因素实验结果与分析

2.2.1 发酵温度对饲用复合酶活力的影响

一般来讲，微生物发酵均存在最适发酵温度。从图1结果来看，发酵温度对饲用复合酶活力存在显著影响，最适发酵温度为36℃，该温度下饲用复合酶总酶活为5590U/g。

2.2.2 发酵时间对饲用复合酶活力的影响

由图2可知，在考察的24h～72h发酵时间内，饲用复合酶活力随时间的增加而增大，但超过72h后，增速减缓，因此从效益角度来看，发酵时间选72h为佳。

2.2.3 转速对饲用复合酶活力的影响

摇床转速主要是影响发酵中溶解氧，由图3可以看出，转速对饲用复合酶活力影响不显著。当转速200r/min时，饲用复合酶活力最高，为5705U/g，故转速宜选200r/min。

2.2.4 接种量对饲用复合酶活力的影响

从图4可知，接种量与中性蛋白酶活力呈正相关。接种量为8%，饲用复合酶活力为5713U/g。但当接种量>8%后，酶活的增速减缓。适当增加接种量，能节约生产时间，但接种量太大则会增加制备种子液的成本，因此接种量宜选8%。

2.3 响应面实验结果与分析

选取对影响中性蛋白酶活力较显著温度（X1）、时间（X2）、接种量（X3）3个因素作为考察对象，其他因素设定为最佳水平。采用Minitab15软件按Box-Behnken方法进行3因素3个水平实验设计。BBD实验结果见表3。

利用Minitab15软件对表4数据进行二次多元回归拟合，得到二次多项回归模型，解得到最佳条件为：X1=-0.18、X2=-0.33、X3=1.62，换算成实际水平，即：发酵温度35.6℃，时间68h，接种量为9.62%，该条件下饲用复合酶的产量达到5764 U/g，比原始条件提高了3.4%。

3 结论

本实验采用响应曲面法研究了混菌发酵菜籽粕产饲用复合酶的条件。确定了混菌发酵菌种为枯草芽孢杆菌、毛霉、酵母菌（1：1：1）;通过单因素实验确定了各显著因素及水平，分别为：温度36℃，时间72h，接种量8.%。在此基础上运用Box-Behnken设计，采用Minitab15软件对实验结果进行多元回归拟合得到二次多项回归模式，通过求偏导数，得到最佳条件为：发酵温度35.6℃，时间68h，接种量为9.62%，该条件下饲用复合酶的产量达到5764U/g，比原始条件提高了3.4%。

参考文献：

[1]刘文冰.浅析我国油菜生产的现状与发展[J].中国种业，2005（1）：17.

[2]佚名.菜籽粕混合菌固体发酵脱毒条件的响应面优化研究[J].动物营养学报，2013，25（3）：617-627.

[3]王晓凡，熊光权，汪兰，等.菜籽蛋白提取及应用研究进展[J].粮食与油脂，2010（12）：5-9.

[4]杨培龙，姚斌.饲料用酶制剂的研究进展与趋势[J].生物工程学报，2009，25（12）：1844-1851.

[5]Wang， Z. Qiao， S.， Lu，W.. Effects of enzyme supplementation on performance， nutrient digestibility， gastrointestinal morphology， and volatile fatty acid profiles in the hindgut of broilers fed wheat-based diets. Poultry Science，2005，84（6）：875.

[6]吴志青，吴华东.饲用复合酶制剂的作用机理及其在动物生产中的应用[J].贵州畜牧兽医，2013，35（1）：21-24.

[7]杜忍让.张强，等.饲料中添加不同水平复合酶制剂对仔猪生长发育的影响[J].西北农业学报，2009，18（2） ： 24-27.

[8]彭胜，郑阳，史丽娟，等.菜籽粕水体系脱毒工艺研究[J].应用化工，2015，44（7）：1223-1229.

[9]兰文菊，彭密军，彭胜，等.菜籽粕脱毒液中植酸的提取及其抗氧化活性[J].食品科学，2011，32（17）：172-175.

[10]罗仓学，史兰，李振尧.菜籽粕脱毒及菜籽蛋白提取工艺优化[J].食品与发酵科技，2013，49（6）：50-54.

[11]GB/T23527-2009.蛋白酶制剂[S].北京：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，2009.

[12]张树政.酶制剂工业[M].北京：科学出版社，1984.

[13]丁小维，田文婷，张波，等.盐湖微生物Fosmid文库纤维酶克隆的筛选及产酶研究[J].陕西理工学院学报（自然科学版），2016，32（1）：59-63.

作者简介：

温拥军（1980- ），男，硕士，副教授，研究方向：微生物发酵工程。

基金项目：湖南省教育厅科学研究项目（16C0548）

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