青蛤酶解物抗氧化活性研究

摘 要：以DPPH自由基清除活性为指标对青蛤酶解条件（即时间、温度、pH、酶添加量和固液比）进行正交试验设计，研究了青蛤蛋白酶解物的抗氧化活性。结果表明，酶解条件为温度40℃、pH 11.5、酶添加量3000U/g原料以及固液比为1∶2（w/w）时，酶解物的DPPH自由基的清除活性最高。对最佳水解条件下所获得的酶解物进行抗氧化活性测试，内容包括DPPH自由基清除活性、超氧阴离子清除活性、羟基自由基清除活性和还原能力。结果显示，酶解物有较低超氧阴离子清除活性，但却具有较高DPPH自由基清除活性、羟基自由基清除活性和还原能力。

关键词：抗氧化；青蛤；酶解；肽

中图分类号 R282 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）08-0025-04

Antioxidative Properties of Hydrolysates Obtained from Cyclina sinensis

Zhang Jingmin et al.

（Ocean Institute，Huaihai Institute of Technology， Lianyungang 222005，China）

Abstract：The hydrolysates were assessed using methods of DPPH radical scavenging ability.The antioxidant properties of enzymatically hydrolyzed Cyclina sinensis were studied.Hydrolysis conditions （viz.，temperature，pH enzyme to substrate level and solid/liquid ratio） for preparing protein hydrolysates from the yclina sinensis meal proteins were optimized by orthogonal design.The results were that temperature of 40℃，pH 11.5，an enzyme to substrate level of 3000U/g ， and ratio of solid/liquid ratio of 1∶2（w/w）， were found to be the optimum conditions to obtain the best antioxidative hydrolysates.In the best hydrolysis conditions， antioxidant activities， DPPH radical scavenging activity including reducing power， superoxide anion and hydroxyl radical scavenging activity，of the hydrolysates were evaluated.The results showed that the hydrolysates of Cyclina sinensis exhibited the lower superoxide anion radical scavenging activities， but the higher reducing powers，DPPH radical scavenging activities and Hydroxyl radical scavenging activities.

Key words：Antioxidant；Cyclina sinensis；Enzymolysi；Peptide

海洋生物长期处于海水这样一个特异的封闭环境里，在进化过程中产生了与陆地生物不同的代谢系统和机体防御系统，因此海洋生物中蕴藏着许多功能特异、结构特殊的生理活性物质。向海洋索取食物、功能蛋白和特殊活性物质，已成为世界各沿海国家海洋开发的一项重要内容，其中海洋活性肽的开发备受科研工作者关注。

氧气的单电子还原特点导致很多活性氧的产生，如超氧阴离子、羟基自由基等[1]。活性氧作为氧化代谢的必然产物，在细胞的生命活动中至关重要。但过多的活性氧会使得脂质过氧化代谢产物丙二醛和脱氧核糖核酸产生交联反应，并由此引起基因损伤等一系列问题[2]。因此，作为机体对氧化应激反应的保护剂，抗氧剂的作用非常重要。一般来说，添加到食品中合成抗氧化剂如丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、叔丁基对苯二酚以及食子酸丙酯等均具有良好的延緩食品脂质氧化功能。但由于合成抗氧化剂使用的安全隐患问题，人们开始越来越关注天然抗氧化剂。因此，人们致力于寻求不同来源的、安全的、天然抗氧化剂。据报道，许多蛋白经水解后可产生抗氧化肽，如牛奶蛋白、牛蛙皮、猪胶原、圆鲹鱿鱼肌肉等[3～5]。

青蛤（Cyclina sinensis）俗称石头螺、圆蛤、蛤俐、黑蛤等，属鳃纲（Lamelliranchia）、帘蛤科（Veneridae）贝类。青蛤肉质鲜肥，深得沿海消费者的喜爱。据李小英等人报道青蛤营养丰富，其中蛋白质每100g鲜品含量为11.55g，必需氨基酸占总氨酸的比例在45%左右[6]，远高于WHO/FAO模式推荐的模式（35.38%），略低于鸡蛋中所占的比例（48.08%）。

青蛤生活适应性比较强，耐温、耐盐性较强，且具有一定的抗污能力，因此能够在我国南北沿海地区生长。近十几年来，随着人工育苗技术的日渐成熟，青蛤在连云港滩涂贝类养殖中也开始占据比较重要的经济地位，青蛤的产量也在逐年增长，因此对于大宗养殖青蛤后续的加工特性、生物活性等方面的研究势在必行。目前对青蛤的研究主要集中在繁殖与养殖生物学、群体遗传与种质资源评价和免疫等方面[7-9]，而对于青蛤的生物活性、加工特性等方面鲜有报道。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 青蛤：购自连云港直销市场，将新鲜青蛤表面的泥沙等残留物刷洗干净，放入60℃水中，待其张开壳后取肉，去除内脏，沥干，再用清水冲洗干净后绞成肉糜，包装于双层聚乙稀袋中，置于-20℃冷冻备用。碱性蛋白酶：无锡雪花酶制剂有限公司提供，20万U/g。DPPH（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl）色谱纯，购于Sigma公司。其它：氢氧化钠、盐酸、三氯乙酸、氯化钙等均为分析纯。

1.2 设备 YP-001N电子精密天平，上海精密科学仪器有限公司；722S型分光光度计，上海楼光技术有限公司；HZS-H水浴振荡器，哈尔滨市东明医疗仪器制造厂；GL-21M高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；pHS-25数显pH计，上海精密科学仪器有限公司；DS-1型高速组织捣碎机，上海标本模型厂。

1.3 酶解工艺流程 青蛤→解冻→匀浆→加热、调pH→加酶→保温水解4h→灭酶（90℃，20min）→破乳化→离心（8000r/min，20min）→上清液[10]

1.4 酶解条件的优化 在预实验基础上，采用正交试验设计研究碱性蛋白酶酶解温度、pH值、加酶量和固液比4个因素对酶解液清除DPPH自由基能力的影响。

1.5 分析方法

1.5.1 酶解物肽含量 采用双缩脲法测定酶解物肽含量。

1.5.2 DPPH自由基（DPPH·）清除活性的测定[11] DPPH自由基清除活性的测定按Bersuder法并稍加改动。将2mLDPPH自由基溶液（0.1mmol/L，溶于95%乙醇）置于试管中，加入一定量待测液定容至4ml，振荡混匀。混合液室温放置30min后，在517nm处测吸光值Ai。对照为2mLDPPH自由基溶液加上2mL蒸馏水，并在517nm处测吸光值Ac。同体积待测液与2ml95%的乙醇定容至4mL，并在517nm处测吸光值为Aj。DPPH自由基（DPPH·）清除活性用清除率SA（Scavenging activity）表示：

SA（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100

1.5.3 羟基自由基（·OH）清除活性的测定[12] 取0.2mL FeSO4-EDTA混合液（10.0mmol/L）于5mL刻度试管中，并加入0.5mL的2-脱氧核糖溶液（10.0mmol/L），再加入0.6mL酶解物，用磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.4）定容至1.8mL，空白及阳性对照管直接用磷酸缓冲液定容至1.8mL。再在样品及阳性对照管中加入0.2mL H2O2（0.1%），空白管加入蒸馏水0.2mL。溶液混匀后置于37℃恒温水浴中反应1h，然后加入质量分数为2.8%三氯乙酸（TCA）溶液1.0mL，4000rpm离心20min。取上清液2.0mL于另一支试管中，加入1.0%（w/w）硫代巴比妥酸（TBA）溶液1.0mL，混匀后置沸水浴中反应15min，冷却后稀释5倍，在波长532nm处测吸光度值。羟自由基清除活性用清除率SA表示，按下式计算：

SA（%）=（Ac-As）/（Ac-A0）×100

式中：Ac为阳性对照管的吸光度；As为样品管的吸光度；A0为试剂空白的吸光度。

1.5.4 超氧阴离子清除活性（O2-·）的测定[13] 向pH8.2，2.8mL的Tris-HCl缓冲液（50mmol/L）中加入0.1mL待测酶解液（空白为等量去离子水），于25℃保温10min。然后加入0.1mL25℃预热的邻苯三酚（60mmol/L）至总体积3.0ml（空白以等量10mmol/L的HCl代替）。再迅速摇匀混合液，倒入1cm比色皿中，在420nm处，每隔半分钟测定一次吸光值A值，线性时间为4min。根据邻苯三酚自氧化速率计算抑制率（控制邻苯三酚的自氧化速率为0.050～0.065O.D./min）。超氧阴离子清除活性用清除率SA表示：

SA（%）=[（△A420′/△T-△A420/△T）/△A420′/△T]×100

式中：△A420′/△T（V0）：邻苯三酚自氧化速率O.D./min；△A420/△T（V）：添加抗氧化剂的样液氧化速率O.D./min。

1.5.5 酶解液还原能力的测定[11] 取一定浓度的样品（1～10mg/mL）0.1mL，加入2.5m1pH6.6的磷酸盐缓冲液（0.2mol/L）和2.5mL1%的铁氰化钾溶液，混匀。将混合物在50℃保温30min后加入2.5mL10%的三氯乙酸，混合后以3000r/min離心10min。然后，取上清液2.5mL，加2.5mL蒸馏水和0.5mL0.1%的FeCl3，室温放置10min后，在700nm波长处比色，比色值越大，还原能力越强。

2 结果与分析

2.1 酶解条件的确定 酶解最佳工艺的正交试验结果见表1。结果表明，碱性蛋白酶酶解青蛤的最佳条件为A1B3C3D1，即酶解温度40℃，pH值11.5，加酶量600U/g，固液比为1∶2。各因素对DPPH自由基清除能力的影响由大到小依次为固液比>加酶量>温度>pH值。

2.2 青蛤肽的抗氧化能力 在以上最佳条件下对青蛤进行水解4h的水解，并对不同浓度青蛤酶水解物进行抗氧化活性测定。

2.2.1 最佳酶解条件下酶解物对DPPH自由基（DPPH·）的清除活性 根据图1可知，青蛤酶解物在淬灭DPPH自由基时呈现类似米氏曲线的特点，即在较低浓度下时清除效率随浓度增加而增加，二者几乎呈线性关系，但当酶解物浓度超过4mg/mL时，若浓度继续增加则清除效率曲线趋于平缓。

2.2.2 最佳酶解条件下酶解物对超氧阴离子的清除活性 邻苯三酚自氧化是一类链式反应，在自氧化过程中，超氧阴离子不断消失又不断产生，达到稳态时，其浓度保持稳定。邻苯三酚在氧化过程中形成一系列在400nm～425nm处有光吸收的中间产物，当pH<9时，邻苯三酚的自氧化率呈超氧阴离子浓度依赖性。

由图2可知，青蛤酶解所获得的混合物对超氧阴离子具有一定的清除能力。低浓度下与清除率效率与浓度存在一定的线性相关性。当酶解混合物浓度为2mg/ml时，清除效率可达32.5%，超过这一浓度时，抗氧化能力的增长趋势明显减弱。

2.2.3 最佳酶解条件下酶解物对羟基自由基的清除活性 如图3所示，在实验所测定的浓度范围内，青蛤酶解物具有较强的清除羟基自由基的能力，并且该能力随浓度的增加而增强。与清除DPPH自由基和超氧阴离子相比，青蛤酶解物清除羟基自由基的能力更强，当酶解物浓度为20mg/ml时，清除效率高达80%。这表明在不同的抗氧化测定体系中，青蛤酶解抗氧化能力的表现有所差异。据此推测多肽清除不同的自由基的机理及发挥抗氧化功能的基团应有所不同。

图3 青蛤蛋白酶解物清除羟基自由基的活性

2.2.4 青蛤酶解物的还原能力 图4显示，青蛤酶解物具有一定的还原力，青蛤酶解物可做为电子供体与自由基进行反应并将它们转化为稳定物质，从而终止自由基链反应。由图4可知青蛤酶解物还原力大小与其浓度高低呈一定的量效关系。这说明青蛤酶解物供电子的能力随浓度的提高而增强，但这种线性关系会随浓度增加而稍有减弱。

圖4 青蛤蛋白酶解物还原力活性

3 结论与讨论

青蛤经碱性蛋白酶水解后可得到具有优良的抗氧化性能酶解物，但限于时间原因，未能对酶解物的进一步分离纯化及表征，同时也未能就酶解物的食品方面功能特性进行检测，后续实验中拟对的酶解物以上两方面内容开展。若能获取良好食品功能特性的酶解物或（和）抗氧化生物活性的纯化肽，则有望提高青蛤产业链的经济效益及社会效益。

参考文献

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（责编：王慧晴）

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