一株产α—淀粉酶嗜热菌的分离鉴定及其产酶条件的优化

材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 从江西省宜春市温汤镇温泉古井采样点1处（温度68 ℃，pH 6.5～6.7）和宰杀禽类温泉水池采样点2处（温度65 ℃，pH 6.2～6.5）分别采样。常温运输， 实验室4 ℃保存。

1.1.2 培养基 富集培养基：牛肉膏蛋白胨基础培养基；α-淀粉酶选择培养基[6]：淀粉10 g，NH4H2PO4 5 g，酵母膏1 g，K2HPO4 0.1 g，MgSO4 0.1 g，柠檬酸三钠 0.5 g， MnSO4 0.1 g，FeSO4 0.1 g，CaCl2 0.2 g，pH 7.2，固体培养基中添加琼脂22 g；种子培养基[7]：可溶性淀粉2.0%，酵母膏1.0%，蛋白胨0.5%，NaCl 0.5%，pH 7.0；基础发酵培养基[7]：可溶性淀粉2.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，NaCl 0.5%，K2HPO4 0.1%，CaCl2·2H2O 0.05%，MgSO4.7H2O 0.05%， FeSO4·7H2O 0.005%，pH 7.0。

1.1.3 主要试剂 博彩生物Taq DNA polymerase、MgCl2、Buffer for Taq DNA polymerase、Fast DL 2000 ladder琼脂糖（上海蓝季科技发展有限公司）；PCR纯化试剂盒[康宁生命科学（吴江）有限公司]。

1.1.4 主要仪器 DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂），ZF-90型暗箱式紫外透射仪（上海顾村电光仪器厂），GZX-9070 MBE型数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），TC-XP-G型梯度PCR仪（杭州博日科技有限公司），722型可见光分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌种筛选 取2处水样放入88 ℃恒温水浴锅中处理15 min，取1 mL处理过的样品接种到已灭菌的50 mL牛肉膏蛋白胨基础培养基中，55 ℃摇床培养24 h。将培养液稀释5个梯度10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，分别取每一浓度0.1 mL 涂布于α-淀粉酶选择培养基上，置于55 ℃培养箱中培养。待菌落形成，将其放置4 ℃冰箱5 h，观察菌落形状、大小和菌落周围透明圈。挑取有透明圈菌株，采用常规的稀释涂布法进行菌株的分离和纯化，滴加路戈氏碘液，观察各菌株产透明圈情况，选取d0/d1（d0为水解圈直径，d1为菌落直径）最大的为本试验出发菌株。

1.2.2 菌株发酵 将出发菌株接种于种子液培养基摇瓶12 h，2%接种量接入发酵培养基中，55 ℃下摇床180 r/min培养24 h。

1.2.3 粗酶液的制备 菌株发酵完成后，经过8 000 r/min离心10 min，取上清液即为粗酶液。

1.2.4 α-淀粉酶活力测定 用姜永明等[8]改良法：取5 mL 0.5%的可溶性淀粉溶液，在40 ℃水浴中预热10 min，然后加适当稀释的酶液0.5 mL，反应5 min后，用5 mL 0.1 mol/L盐酸终止反应。取0.5 mL反应液与5 mL稀碘液显色，在620 nm处测光密度。以0.5 mL水代替0.5 mL反应液为空白，以不加酶液（加柠檬酸缓冲液pH 6.0）为对照。计算公式：酶活力=（R0-R）/R0×50×D，其中R0、R分别表示对照和反应液的光密度，D为酶稀释倍数。调整D使（R0-R）/R0在0.2～0.7。酶活力单位定义：在40 ℃，5 min内水解1 mg淀粉的酶量为一个活力单位。

1.2.5 菌种鉴定方法 常规鉴定参见文献[9]、[10]；分子鉴定参见文献[11]中的方法进行。

1.2.6 产酶条件优化 以单因素试验考察碳源、氮源、初始pH、发酵温度等条件，按2%的接种量接种，180 r/min水浴培养后，测定粗酶液酶活力，确定目标菌株最佳发酵碳源、氮源、初始pH、发酵最佳温度。

1.2.7 菌种YC-15总DNA的提取与检测 取1.5 mL培养液于EP管中，13 000 r/min离心5 min，弃上清液。向沉淀物中加入1 mL get缓冲液，冰上放置3 min，13 000 r/min离心5 min。弃上清液，加入0.6 mL TE缓冲液制成悬浊液。向悬浊液中加入60 μL 1%SDS剧烈振荡。放入65 ℃水浴30 min溶液变性。加入等体积Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），振荡10 min离心15 min保留上清液。加入等体积饱和酚再抽提1次，取上清液。向上清液中加入1/10体积3 mol/L NaAc。加入等体积异丙醇，离心10 min弃上清液。用70%乙醇洗涤，留沉淀，加入80 μL TE缓冲液。琼脂糖凝胶电泳检测DNA。

1.2.8 16S rDNA PCR扩增、序列测定及分子系统发育树的构建 以提取YC-15菌株总DNA 为模板， 对16S rDNA基因序列进行PCR 扩增。引物序列：27F：（5’-ATTCCGGTTGATCCTGC-3’）和1541R：（5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’）。PCR 采用50 μL 反应体系，反应条件： 94 ℃预变性4 min ，94 ℃变性1 min ，退火温度设置（58、57.4、56.4、54.9、53.1、51.5、50.5、50.0 ℃）8个梯度40 s ，72 ℃延伸2 min，循环30次；72 ℃保持10 min。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增结果， 并通过PCR 产物纯化试剂盒进行纯化。PCR 产物由上海生工生物工程有限公司进行测序，测得的ITS序列在GenBank中进行BLAST，应用MEGA6.0软件中邻接法（Neighbour-joining methods，NJ）构建聚类分析树状图，bootstrap检验值≥50%，1 000次重复。

2 结果与分析

2.1 产α-淀粉酶的嗜热菌株的筛选

将宜春温泉采集到的水样富集，以梯度稀释涂布于α-淀粉酶选择培养基平板，置于55 ℃培养箱中培养，待菌落形成，将其放置4 ℃冰箱5 h，观察菌落周围透明圈，初步确定为产α-淀粉酶嗜热菌株。再将菌株以稀释平板法进一步分离纯化。滴加路戈氏碘液，测定淀粉水解圈大小，选取d0 /d1最大的YC-15作为本试验出发菌株（表1）。

2.2 产α-淀粉酶菌株YC-15的鉴定

2.2.1 菌株YC-15形态观察 YC-15菌落在平板上产生的透明水解圈（图1）。菌落圆形较大，边缘较平滑，略有小齿，表面褶皱干燥，乳白色。光学显微镜下可以观察到菌株为短杆菌，中生芽孢（图2）。

2.2.2 菌株YC-15生理生化测定 对菌株YC-15进行了鉴定，结合形态学和生理生化特征（表2），初步鉴定YC-15菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

2.3 菌株YC-15总DNA和16S rDNA的电泳

产淀粉酶的嗜热菌株YC-15总基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图谱见图3，提取的16S rDNA-PCR显示在2 000 bp附近出现了清晰的条带，测序结果表明，PCR扩增得到的16S rDNA区域的目的片段大小为1 454 bp。16S rDNA电泳如图4所示。

2.4 菌株YC-15 16S rRNA序列分析

基于菌株16S rRNA序列采用邻接法构建了系统发育树以确证YC-15菌株的分类归属（图5），菌株与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的16S rRNA序列相似性达98%，可以看出YC-15菌株应归为枯草芽孢杆菌。

2.5 菌株YC-15产酶条件的优化

2.5.1 YC-15菌株生长曲线 由图6中生长曲线与相应时间产酶曲线可知，4～14 h为YC-15菌株对数生长期，16 h后菌体生长进入稳定期；而α-淀粉酶活力在培养12 h后开始迅速增加，32 h时α-淀粉酶酶活力达到最高，随后酶活力开始降低。

2.5.2 碳源对菌株YC-15产酶能力的影响 以蛋白胨为氮源，改变基础发酵培养基中碳源的种类，配制液体发酵培养基。121 ℃灭菌20 min。以250 mL三角瓶装液50 mL发酵培养基，按0.5%的接种量接种，55 ℃，180 r/min摇床培养32 h后测定粗酶液酶活力（图7）。由图7可知，以淀粉为碳源时酶活力最高。

2.5.3 氮源对菌株YC-15产酶能力的影响 以淀粉为碳源，改变基础发酵培养基中氮源的种类，配制液体发酵培养基（图8）。由图8可知，以0.5%酵母膏+0.5%蛋白胨为氮源产酶能力最强。

2.5.4 培养基初始pH对菌株YC-15产酶能力的影响 以淀粉为碳源、0.5%酵母膏+0.5%蛋白胨为氮源，改变发酵培养基的初始pH，55 ℃温度下180 r/min摇床培养32 h（图9）。由图9可知，培养基初始pH为7时菌株产酶能力最强，而在pH 5～9酶活力相对稳定。

2.5.5 培养温度对菌株YC-15产酶能力的影响 将已优化碳源、氮源、初始pH的发酵培养基在9个温度下180 r/min摇床培养32 h（图10）。由图10可知，经过酶活力测定得知55 ℃培养时菌株产酶能力最强。在50～60 ℃酶活力较稳定，在90 ℃时的酶活力可达最大值的50%。

3 结论

本研究系宜春市温汤镇温泉水域中筛选得到的一株产α-淀粉酶菌株YC-15，通过对其16S rRNA 基因序列分析，结果显示，YC-15与枯草芽孢杆菌的16S rRNA 序列相似性达98%，结合其形态、生理生化特征，进一步证明了YC-15在分类上应归属枯草芽孢杆菌。并对YC-15生长和产酶条件进行了研究，结果表明，4～14 h 为YC-15菌株对数生长期，最佳碳源2%可溶性淀粉，最佳氮源0.5%酵母膏+0.5%蛋白胨，最适产酶初始pH为7.0，pH 5～9酶活力相对稳定，最适产酶温度55 ℃，在90 ℃时的酶活力可达最大值的50%，由此可见，菌株pH适用范围广，具有一定的耐热性，有望进一步诱变，增强菌株对热稳定性和提高产酶能力，实现高温发酵，以应用于淀粉加工、酒精、味精、啤酒、有机酸和饲料等行业。

参考文献：

[1] PANDEY A， NIGAM P，SOCCOL C R，et al. Advances in microbial amylases[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry，2000，31：135.

[2] SHIVRAMAKRISHNAN S，GANGADHARAN D，NAMPOOTHIRI KM et al. Amylases from microbial sources-an overview on recent developments[J]. Food Technol Biotechnol，2006，44：173-84.

[3] 张继千，吴 波，郑冰心，等.海洋菌W11产中温淀粉酶的酶学特性[J].基因组学与应用生物学，2010，29（1）：71-74.

[4] 权淑静，解复红，马 焕，等.一株产酸性α-淀粉酶菌株的筛选及酶学性质研究[J].贵州农业科学，2014，42（2）：103-105.

[5] 胡建恩，曹 茜，杨 帆，等.耐高温α-淀粉酶高密度高表达发酵条件的优化[J].食品科学，2012，33（1）：219-225.

[6] 杨国俊，黄日波.产淀粉酶和蛋白酶中度嗜热细菌的分离、筛选及培养[J].广西农业大学学报，1995（3）：243-247.

[7] 徐 颖，刘 琦，王 乐，等.一株耐高温淀粉酶生产菌的分离鉴定及其产酶条件优化[J].四川大学学报（自然科学版），2008， 45（4）：991-996.

[8] 姜永明，史永旭，隋德新.枯草芽孢杆菌86315 α-淀粉酶的研究Ⅱ：分离提纯、性质及动力学[J].江苏农学院学报，1992，13（2）：47.

[9] R E布坎南，N E吉本斯.伯杰细菌鉴定手册[M].第八版.北京：科学出版社，1984.

[10] 沈 萍，陈向东.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，2007.

[11] 魏 群.分子生物学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2011.

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