Ⅱ型猪链球菌的分离鉴定及药敏试验

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作者简介 刘运镇（1978—），男，江苏邳州人，讲师，硕士，从事兽医临床研究。通信作者，副教授，硕士，从事动物传染病研究。

收稿日期 2019-05-16;修回日期 2019-05-28

猪链球菌病是由致病性猪链球菌感染引起的一种人畜共患病[1]。猪链球菌是猪的一种常见和重要病原体，发病猪主要表现为脑膜炎、心内膜炎、肺炎、关节炎和败血症等症状。少部分患者发生链球菌中毒性休克综合征，严重病例病情进展非常快，如果诊断、治疗不及时，预后较差，病死率极高[2-4] ，对我国养猪业有很大的影响，目前我国抗生素主要用于猪链球菌疾病的预防和治疗，由于长期使用抗生素，导致耐药性的产生，使得猪链球菌的发病率和死亡率显著上升。2018年12月，江苏某猪场发生疑似猪链球菌病例。笔者通过细菌分离培养、生化试验、PCR鉴定确定为Ⅱ型猪链球菌感染，通过药敏试验确定其耐药性，为该养殖场及周边猪场猪链球菌病的防控提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集。采用李淼[5]的方法对疑似发病猪分别进行鼻腔拭子和肺脏、脑组织的采集，所有病料采集严格按照无菌操作，采集后2 h内送往实验室进行检测。

鼻腔拭子采集：对疑似发病猪的鼻孔周围，用灭菌水进行清洗后，将灭菌过的医用棉签插入鼻孔中，旋转360°后取出，放入灭菌的1.5 mL EP管中（装有含5%的无菌小牛血清的TSB培养基），封盖、标记后放于冰盒保存。肺脏采集：用灭菌过的组织剪，从喉头下端将气管剪断，连同肺脏一起取出放于封口袋中，标记后放于冰盒保存。脑组织采集：将疑似发病猪的颅骨切一方形小口，用灭菌过的组织剪将将脑组织轻轻挑出，放于封口袋中，标记后放于冰盒保存[5]。

1.1.2 试剂。 TSB肉汤培养基、小牛血清和药敏试纸（购自杭州天和生物制品有限公司）、灭菌水（自制）、哥伦比亚绵羊鲜血平板、DNA提取试剂盒、2×ES Taq MasterMix（购于上海晶抗生物工程有限公司）。

1.1.3 引物的设计与合成。

根据GenBank数据库已发表的SS基因序列，通过比对分析后找出保守序列，使用Primer Premier 5软件针对保守序列设计引物SS-F和SS-R，并以阳性样品为模板进行PCR扩增，得到预期大小为415 bp的片段[6]。对分离的猪链球菌继续进行分型检测，根据设计引物SS1-F、SS1-R、SS2-F、SS2-R、SS7-F、SS7-R、SS9-F、SS9-R进行PCR扩增，获得预期大小分别为719、524、710、569 bp的片段，见表1。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养。采用李淼[5]的方法对采集的病料进行细菌分离与培养。

鼻腔拭子的细菌分离培养：冰盒保存的鼻腔拭子1.5 mL EP管放于恒温培养箱37 ℃培养2 h后，用移液枪吸取20 μL培养液滴入哥伦比亚绵羊鲜血平板中，用灭菌接种环涂抹均匀，标记后放于37 ℃恒温培养箱中培养12 h，然后用接种环挑取具有浅绿色溶血环的疑似猪链球菌小菌落，在另外一个哥伦比亚绵羊鲜血平板中划线、标记后，将平板放于37 ℃恒温培养箱中纯培養24 h[5]。

肺脏和脑组织的细菌分离培养：用组织剪剪取0.5 g左右组织，剪碎后放入匀浆机中匀浆5 min，确保其充分打碎，然后将破碎的的组织用生理盐水1 000倍稀释，充分混合均后;用移液枪取20 μL稀释液滴入哥伦比亚绵羊鲜血平板中，用灭菌接种环涂抹均匀，标记后放于37 ℃恒温培养箱中培养12 h，然后用接种环挑取具有浅绿色溶血环的疑似猪链球菌小菌落，在另外一个哥伦比亚绵羊鲜血平板中划线、标记后，将平板放于37 ℃恒温培养箱中纯培养24 h[5]。

1.2.2 细菌的染色镜检。用灭菌接种环挑取疑似猪链球菌纯培养物菌落，采用革兰氏染色法染色，置于高倍显微镜下镜检，观察细菌形态。

1.2.3 生化试验。

将分离培养得到的菌株接种到进行甘露醇、蔗糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、七叶苷等生化反应管中，37 ℃条件下培养48 h，观察生化反应特征。

1.2.4 PCR鉴定。

参照邹君等[7]建立的多重PCR检测方法，采用煮沸裂解法制备细菌 DNA 模板。取适量的过夜培养液，以12 000 r/min离心5 min，弃去培养基，用无菌超纯水洗涤沉淀2次，并用100 μL超纯水重悬细胞。100 ℃金属水浴锅作用 10  min，置于冰浴中冷却10  min，12 000 r/min 离心 10  min，取上清液作为 DNA 模板。PCR反应体系如下：Premix Taq 12.5 μL、正向引物 0.5 μL、反向引物 0.5 μL、cDNA样品 2 μL，补ddH2O至25 μL。PCR反应程序如下：94 ℃  5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃延伸45 s，40个循环;72 ℃延伸10 min;16 ℃ 1 min。按照琼脂糖凝胶电泳SOP（编号）对PCR扩增产物进行凝胶电泳，并判断结果。

1.2.5 药敏试验。

按照CLSI M100的标准进行药物试验。用灭菌棉签刮取细菌纯培养物，使之溶解于灭菌生理盐水中，将菌落浓度调整为0.5麦氏单位，取适量菌悬液均匀涂布于MH琼脂平板上，略干后贴上药敏纸片，于37 ℃下培养18 h后，测量抑菌环直径[8]。判定标准如下：抑菌圈直径 <10 mm为耐药，抑菌圈直径 10～15 cm为中度敏感， 直径>15 mm则为高度敏感。

2 结果与分析

2.1 细菌分离结果

待检病料经过24 h培养，鼻拭子病料分离到1株可疑菌株，在鲜血培养基上菌落呈针尖大小、圆形隆起，湿润透明，灰白色，菌落周围形成完全透明的溶血圈，为β-溶血[9]。

2.2 细菌的染色镜检

在革兰氏染色后，显微镜检查显示病料培养物为球菌，呈单个、成对，短链或长链排列，且革兰氏染色为紫色（阳性），其病料组织触片镜检细菌形成对、短链、无鞭毛、无芽胞。

2.3 生化试验结果

由表2可知，3种病料培养的菌落生化特征均与链球菌生化指标相一致。

2.4 PCR鉴定结果

通过琼脂糖凝胶电泳SOP（编号）对PCR扩增产物进行电泳，扩增到524 bp大小片段，结果如图1所示。

通过PCR扩增，分离细菌基因检测结果为阳性，说明该猪场发病猪分离菌株为Ⅱ型猪链球菌。结合病理变化和生化试验结果，可确定该猪场发生Ⅱ型猪链球菌病。

注：1.Marker;2.样品;3.阳性对照（2型链球菌，524 bp）;4.阴性对照

Note：1.Marker;2.Sample;3.Positive control （S.suis type 2， 524 bp）;4.Negative control

图1 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果

Fig.1 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplification products

2.5 药敏试验结果

由表3可知，该猪场分离出的菌株对较多药物具有较强的耐药性，该分离菌株对头孢曲松、哌拉西林、氨苄西林、呋喃唑酮等药物高度敏感，而对环丙沙星、红霉素、庆大霉素、阿莫西林、诺氟沙星等药物不敏感。经调查发现该猪场在日常生产中经常采用环丙沙星、红霉素、庆大霉素等药物进行疾病防控，导致耐药性的产生。

3 讨论

对送检的病死猪病料，分别进行了猪复红细胞体、圆环病毒、弓形虫等疾病的病原体检测，检测结果为阴性，对链球菌的病原体检测从细菌分离培养、染色镜检、生化试验、PCR等方面鉴定分离到的病原为链球菌，从而確诊该猪场发生了猪链球菌病。

链球菌具有多种细菌且在自然界中广泛分布，引起许多动物（如人、猪、牛、马、绵羊和家禽等）的感染。猪链球菌的特征是败血症和局灶性淋巴结病。猪链球菌感染猪的生殖和消化道、上呼吸道。其中，以Ⅱ型猪链球菌最常见、毒性最强。致病因素包括胶囊、溶菌酶释放蛋白（MRP）、细胞外因子（EF）和溶血素。这种胶囊可以防止细菌被吞噬。溶菌酶释放蛋白和细胞外因子的存在增强了菌株的毒力。这种细菌的抵抗力不强，对干燥、湿热比较敏感，常用的消毒剂就可以杀灭它。

链球菌为革兰氏阳性菌，在理论上许多抗生素对其具有明显的抗菌作用。药敏试验结果表明，分离到的链球菌对头孢曲松、哌拉西林、氨苄西林、呋喃唑酮等药物具有较高的敏感性，而其对环丙沙星、红霉素、庆大霉素、阿莫西林、诺氟沙星等药物不敏感，主要是由于该猪场在生产过程使用了大量的抗生素，导致耐药菌株的产生。通过药敏试验筛选合适药物，结合猪场实际生产情况，确定合理的用药方案，选择合适的路径和剂量，可有效控制疫情的发生。刘佩红等[10]研究表明不同猪场对药物的耐药性也不同，也说明在猪场日常生产中进行临床用药时，应尽可能采用轮换用药、联合用药等方式，避免耐药菌株的产生[11]。

参考文献

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[4] 蒋红，王宏军，周铁忠，等.银翘天甘对猪链球菌Ⅱ型病理模型的防治试验[J].中国农学通报，2012，28（29）：44-48.

[5] 李淼.猪链球菌常见血清型PCR方法的建立及应用[D].长沙：湖南农业大学，2016.

[6] 朱岩昆.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及OmpD15蛋白的抗原性分析[D].新乡：河南师范大学，2013.

[7] 邹君，王楷宬，田莉莉，等. 链球菌猪主要致病种和型多重PCR检测方法的建立[J].中国兽医科学，2011，41（7）：701-706.

[8] 孙萌，白飞飞，徐丹丹，等.一株狐源猪链球菌的分离与鉴定[J].黑龙江畜牧兽医，2018（4）：206-207，242.

[9] 白昀，覃伦，龙剑明，等.猪链球菌9型的分离与鉴定[J].上海畜牧兽医通讯，2007（1）：36-37.

[10] 刘佩红，沈素芳，王永康，等. 上海地区猪源链球菌分离株的病原特性鉴定[J].中国兽医学报，2001，12（1）：42-46.

[11]  张慧，杨旭兵，董雅琴，等.某发病猪场链球菌的分离鉴定及药敏试验[J].中国动物检疫，2018，35（1）：78-80，99.

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