利用双荧光素酶报告系统鉴定靶向作用猪CD163基因的miRNA

报告系统检测发现，与阴性对照组相比，miR-181c、miR-181d、miR-23b和miR-4262均可极显著（P<0.01）抑制荧光素酶的相对活性，其中miR-181d抑制效果最佳。

关键词：双荧光素酶报告系统；miRNA；CD163基因；猪

中图分类号：R318； Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）19-4854-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.052

Abstract： CD163 gene is one of the most important PRRSV entry mediators， which determines the cell susceptibility for PRRSV. If we can identify the miRNAs inhibiting CD163 gene expression， the anti-PRRSV miRNAs can be further acquired. In the present study， we got the full porcine CD163 3′UTR sequence by 3′RACE （Rapid-amplification of cDNA ends） sequencing， and found that it existed targeting sequences of miRNA，including miR-181c，miR-181d，miR-23b and miR-4262，by bioinformatics analysis. The results of dual luciferase reporter assay showed that miR-181c，miR-181d，miR-23b and miR-4262 could significantly reduced the related luciferase activity of reporter construct compared with the NC control group （P<0.01）， especially for miR-181d. These results indicated that the 4 miRNAs could directly target to porcine CD163 gene，which layed a foundation for the further screening of anti-PRRSV miRNAs in the future.

Key words： dual luciferase reporter system； miRNA； CD163 gene； pig

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染引起的一种危害极大的传染性疾病，因发病猪耳部发绀呈紫红色斑块状，又称蓝耳病，主要导致母猪繁殖障碍（流产、死胎、弱胎、木乃伊胎等）、各年龄阶段猪的呼吸道症状、哺乳仔猪的高死亡率、免疫抑制和持续性感染等[1]，造成巨大的经济损失。PRRSV侵入宿主细胞首先通过与细胞膜表面上的特异性受体结合，利用细胞内吞作用感染易感细胞[2]，因此这些特异性受体存在与否决定了细胞对PRRSV的易感性。CD163是PRRSV感染宿主细胞的关键受体之一，参与介导病毒的内吞和增殖。

CD163是一种清道夫受体（Scavenger receptor），在PRRSV感染宿主细胞中起重要作用，主要参与病毒脱壳和基因组RNA的释放过程。在PRRSV非易感细胞系（BHK-21、PK-15、NLFK）中转染CD163真核表达质粒可以使这些细胞系感染 PRRSV 并在细胞内产生子代病毒粒子[3，4]。CD163的表达量高低与PRRSV复制效率呈正相关，上调CD163表达会增加病毒增殖，而下调CD163表达可降低病毒增殖[5]。猪肺泡巨噬细胞（PAM）是PRRSV的天然靶细胞，而采用CD163的抗体可以有效阻止PRRSV感染PAM[3]。永生化的PAM细胞系因无法正常表达CD163而变为PRRSV非易感细胞[6]。CD163是PRRSV感染过程中的关键受体，在PRRSV感染PAM或者是Marc-145细胞的过程中都必须要有CD163的表达。

MicroRNA（miRNA）是一类长约22 bp、高度保守的内源性非编码RNA分子，其表达具有明显的组织和时间特异性，能够互补或部分互补的与靶mRNA结合，使mRNA降解或介导其翻译抑制。成熟的miRNA可同时封闭多个靶基因的翻译，干预调节miRNA可改变多个靶基因的表达水平，且干预调节效率很高[7]。miRNA在病毒感染和宿主天然免疫中起关键作用，参与病毒与宿主的互作，它有可能是细胞最原始的免疫方式。在小鼠中发现miR-126可通过靶向作用于VEGFR2调控病源引起的天然免疫反应[8]。在人巨噬细胞中，miR-155可靶向作用于SOCSS1，刺激干扰素信号通路下游基因表达，参与抗病毒天然免疫过程[9]。

猪CD163基因在PRRSV感染宿主猪细胞的过程中起关键作用，同时miRNA介导的基因调控对调节机体免疫功能具有重要作用，广泛参与机体抗病毒反应。miRNA多数是通过与靶基因的3′UTR区序列特异性识别来实现对基因表达的调控作用，因此本研究构建了猪CD163基因3′UTR双荧光素酶报告载体，筛选鉴定了靶向调控猪CD163基因的miRNA，可为筛选抑制PRRSV感染增殖的miRNA奠定基础。

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