马克斯克鲁维酵母菌的分离鉴定与所产乳糖酶酶学性能研究

摘要：为研究开发具有应用价值的新型微生物资源，用邻硝基苯酚β-D-半乳糖苷 （ONPG ） 法，从雪莲菌发酵乳中分离到一株产乳糖酶的酵母菌株XL-B36，通过分子鉴定，确定该菌为马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）。对该菌所产乳糖酶酶学性能进行研究，该酶最适反应温度和最适pH值分别为47℃和7.0，在35 ～ 40℃具有良好的穩定性。pH 5.0 ～ 8.0表现稳定，pH 7.0 时出现酶活峰值。金属离子Mn2+、Mg2+、Na+对酶活具有激活作用，Ca2+和Zn2+对酶活具有抑制作用，Cu2+和EDTA对酶活具有完全抑制作用。

关键词：马克斯克鲁维酵母；β-半乳糖苷酶；分子鉴定；酶学性质

中图分类号：S182 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）11-0066-06

Abstract In order to research and develop new microbial resources with applied value， a novel lactase-producing yeast XL-B36 was selected from fermented milk by ONPG method and identified as Kluyveromyces marxianus by molecular identification. The enzymatic properties of lactase produced by it were studied and the results showed that the temperature and pH value of β-galactosidase were 47℃ and 7.0， respectively. The enzyme was stable at pH 5.0～8.0，and 35～40℃. The activity of β-galactosidase was promoted by Mn2+，Mg2+ and Na+，but inhibited by Ca2+ and Zn2+. It could be completely inhibited by Cu2+ and ethylene diamine tetraacetic acid （EDTA）.

Keywords Kluyveromyces marxianus； β-galactosidase； Molecular identification； Enzymatic properties

乳糖酶即β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，又名β-半乳糖苷酶（β-galactosidase），是一类催化β-D-半乳糖苷键发生水解的酶，能将乳糖水解成半乳糖和葡萄糖，对解决人体存在的乳糖不耐受具有重要意义[1]。不同种类微生物所产乳糖酶性能不同，霉菌产生的乳糖酶最适pH偏酸性，可应用于酸性乳清和奶酪的水解；而酵母菌和细菌所产乳糖酶最适pH 近中性，适于牛乳和鲜乳清的水解[2-4]。随着对传统发酵乳制品研究的深入，越来越多的酵母菌种、属在各种乳制品中被检出，包括开菲尔酸奶、蒙古酸马奶、苏丹发酵乳Rob、匈牙利发酵乳等[5-8]。王远微等[9]从西部牧区10份传统发酵牦牛酸奶样品中鉴定出16株马克斯克鲁维酵母菌。谢婕等[10]从传统发酵牦牛酸乳中鉴定得到马克斯克鲁维酵母17株（47.2%）、酿酒酵母6株（16.7%）、平常假丝酵母5株（13.9%）、喜仙人掌毕赤酵母4株（11.1%）、发酵毕赤酵母3株（8.3%）。马克斯克鲁维酵母具有减少食品中乳糖含量的作用，可通过发酵分解乳糖，产生多种羰基化合物和挥发性脂肪酸，这些芳香物质也是形成乳制品独特风味的主要原因之一[10]。本试验从特色雪莲菌发酵乳中分离到一株产乳糖酶的酵母菌株，利用18S rDNA技术对菌株进行分子鉴定，研究酵母菌乳糖酶的特性，为挖掘利用自然界特殊功能微生物资源和开发利用乳糖酶提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

市售雪莲菌牦牛酸奶；酵母基因组DNA提取试剂盒，购自Solarbio公司；通用引物EF3 （5′-TCCTCAAATGACCAAGTTTG-3′）和EF4 （5′-GGAAGGGRTGTATTTATTAG -3′）及ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′）和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3′），由上海生物工程有限公司合成；PCR buffer、Taq酶、dNTP，购自宝生物（大连）生物工程有限公司。

5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖糖苷（X-gal，色谱纯），邻硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷 （ONPG，色谱纯），购自Bio Basic Inc公司（上海生物工程有限公司分装）；邻硝基苯酚 （ONP），购自国药集团化学试剂有限公司。

ONPG磷酸盐缓冲液制备：0.602 5 g ONPG溶于100 mL磷酸盐缓冲溶液；pH 7.0磷酸盐缓冲溶液制备：13.6 g磷酸二氢钠、0.06 g硫酸镁、0.126 g氯化锰溶于1 L水；柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液制备：0.1 mol/L柠檬酸与0.2 mol/L磷酸氢二钠混合；0.1 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液制备：0.2 mol/L的醋酸和0.3 mol/L的醋酸钠混合后稀释一倍；0.05 mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液制备：0.2 mol/L的甘氨酸和0.2 mol/L的氢氧化钠混合。PDA培养基制备：去皮马铃薯200 g加蒸馏水1 000 mL，煮沸20 ～ 30 min，2层纱布过滤，弃滤渣。葡萄糖20 g、琼脂20 g、补充蒸馏水至1 000 mL，自然pH。种子培养基（g/L）制备：乳糖20 g、酵母膏3.5 g、蛋白胨3.5 g、 pH 6.0。发酵培养液制备：乳糖80 g/L，葡萄糖5 g/L，酵母膏7 g/L，尿素1.5 g/L，KH2PO4 15 g/L，MgSO4 1 g/L，MnCl2 0.1 g/L，pH 6.6 ～ 6.8。

冷冻高速离心机 （美国Thermo Fisher公司）；PCR仪 （日本Takara公司）；UP200s型超声波破碎仪 （德国Dr. Hielscher公司）；TSQ-280型立式摇床 （上海精宏实验设备有限公司）；723型可见分光光度计 （上海光谱仪器有限公司）。

1.2 酵母菌分离与产乳糖酶筛选

将1 mL雪莲菌牦牛酸奶加入盛有9 mL无菌生理盐水的试管中，涡旋器振荡混匀，制成10-1稀释液，依次进行梯度稀释。选取10-4、10-5、10-6稀释液100 μL分别涂布PDA平板，30℃培养48～72 h，对长出疑似酵母菌的菌落（乳白或灰乳白色）显微镜观察细胞形态，划线纯化至单菌落，4℃斜面保存。

乳糖酶X-gal初筛：将24 mg X-gal溶解于6 mL二甲基甲酰胺（DMF），配制成终浓度为4 mg/mL 的溶液，取该溶液200 μL涂布PDA平板，待表面干燥后，划线接种上述挑选出来的菌株。30℃培养48～72 h，菌落变为蓝色的为产乳糖酶菌株。

1.3 β-D-半乳糖苷酶活性测定

1.3.1 标准曲线绘制 取6支试管分别加入200 μg/mL的ONP溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，磷酸盐缓冲液补足至1 mL，37℃水浴10 min。分别加入0.5 mol/L Na2CO3 4 mL。以第一只试管为空白，测OD420值。以ONP浓度（mmol/L）为纵坐标，OD420值为横坐标绘制标准曲线。

1.3.2 酶的发酵与提取 挑取斜面菌种，接入装有50 mL种子培养基的三角瓶 （250 mL）中，28℃、100 r/min旋转振荡培养20 h。按质量分数为3%的接种量将种子液接入发酵培养液中，28℃、150 r/min旋转振荡培养18 h。取4.0 mL发酵液，7 000 r/min离心5 min，倾去上清液，菌体用0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液 （pH 7.0） 洗涤，7 000 r/min离心 5 min，重复洗涤两次。加入浓度为0.1 mol/L的磷酸缓冲液（ pH 7.0，含浓度为0.5 mmol/L MgSO4，浓度为0.1 mmol/L MnCl2） 至4.0 mL悬浮菌体，置冰水浴中超声波破碎。振幅30%，间歇破胞15 min，4℃、10 000 r/min离心5 min ，取上清液测酶活。

1.3.3 酶活性测定 取1 mL酶稀释液，37℃水浴预热5 min，加入已预热至37℃含20 mmol/L ONPG磷酸盐缓冲液1.0 mL，37℃水浴反应10 min，立即加入0.5 mol/L Na2CO3 3 mL终止反应，测OD420值。以65℃加热失活的酶液作为空白对照。一个酶活力单位（U）定义为：37℃条件下，水解1 min产生1 μmol ONP 所需要的酶量。X= （C×20×N）/10。其中，X为乳糖酶活力；C为标准曲线上对应的ONP浓度；N为稀释倍数。

1.4 18S rDNA基因的克隆、测序

采用酵母基因组DNA提取试剂盒提取DNA，利用通用引物EF3、EF4 和ITS1、ITS4分别扩增酵母菌18S rDNA 和ITS序列。PCR反应体系 （20 μL）：超纯水13.4 μL，10 × PCR buffer 2 μL，dNTP 0.3 μL，引物各1 μL，Taq酶0.3 μL，DNA 2 μL。PCR扩增条件为：①94℃ 5 min；94℃ 45 s，51℃ 1 min，72℃ 2 min，30个循环；72℃ 10 min。② 95℃ 5 min；95℃ 45 s，60℃ 1 min，72℃ 1 min ，30个循环；72℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，交由华大基因（武汉）中心测序。

1.5 系统发育树构建

在NCBI网站对测得的18S rDNA 和ITS分别进行序列间的BLAST分析或通过DNAMAN 6.0进行序列相似性分析。利用Mega 3.1软件中的Kimura双参数模型计算各序列间距离，采用邻位相连法（Neighbor-joining，NJ）构建系统进化树。

1.6 β-D-半乳糖苷酶酶学性能

1.6.1 最适反应温度与热稳定性 最适反应温度：取9份200 μL磷酸盐缓冲液（pH 7.0）稀释的酶液分别于30、35、37、40、45、47、50、55、57℃保温5 min，同时将9份200 μL ONPG溶液分别在上述温度下保温5 min后加入到酶液中，在各温度下反应10 min，加入0.5 mol/L Na2CO3 600 μL终止反应。计算各温度酶活与最高酶活百分比，确定酶最适反应温度。

酶的热稳定性：将200 μL磷酸盐缓冲液稀释的酶液，分别于35、40、45、50、55℃保温0、20、40、60、80 min。同时将200 μL ONPG溶液分别在上述温度下保温 0、20、40、60、80 min，将ONPG加入到粗酶液中，37℃反应10 min，加入0.5 mol/L Na2CO3 600 μL终止反应，测OD420值，以65℃加热失活的酶液作为空白对照，以保温开始时酶活为100%，计算各时间酶活与最高酶活百分比。

1.6.2 最适pH值和pH穩定性 最适pH值：分别配制pH 2.0～10.0的缓冲液 （pH 2.0～3.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH 4.0～5.5乙酸-乙酸钠缓冲液、pH 6.0～8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH 9.0～10.0的0.05 mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液），在最适温度下，按1.3.3酶活测定方法，测定pH 3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0和10.0条件下酶活性。计算各pH酶活与最高酶活百分比，确定酶最适反应pH值。

pH稳定性：将酶液分别置于pH为3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0和10.0的缓冲溶液中，37℃保温60 min后置冰上，然后将pH值调回至7.0，测定各pH条件下的酶活，以最高酶活为100%，计算各pH酶活与最高酶活百分比，测定酶的pH稳定性。

1.6.3 金属离子和EDTA对酶活的影响 在酶促反应体系中加入1 mol/L的Mn2+、Mg2+、Na2+、K2+、Ca2+、Cu2+ 、Zn2+、EDTA溶液，使最终反应体系中金属离子浓度为1 mmol/L。以加热失活的酶液作为空白对照，不加金属离子和EDTA溶液的酶活作为对照，计算相对酶活。

2 结果与分析

2.1 酵母菌产乳糖酶能力筛选与菌种鉴定

利用PDA平板进行酵母菌分离培养，对培养出的酵母菌利用X-gal培养基进行产乳糖酶能力筛选，得到一株产酶能力强的酵母菌株XL-B36，菌体在PDA培养基呈圆形或椭圆形，菌体直径2.8～5.0 μm，芽殖。

测序结果表明，XL-B36菌株18S rDNA序列全长1 690 bp，符合预期值。BLAST显示与大多数克鲁维酵母属（Kluyveromyces）聚成一族，同源性为99%。系统发育分析显示与鉴定为马克斯克鲁维酵母聚为一族，因此鉴定XL-B36菌株为马克斯克鲁维酵母（图1）。

2.2 ONPG标准曲线

以光密度OD420值为横坐标，ONP 浓度为纵坐标绘制乳糖酶活标准曲线，相关系数R2=0.998（图2），说明该标准曲线可用于乳糖酶的测定。

2.3 XL-B36乳糖酶最适反应温度与热稳定性

在30～47℃范围内，乳糖酶活性随温度升高而增加，47℃条件下活性最高，之后随温度升高活性快速下降，55℃降至最高酶活的34.3%，至57℃已检测不到酶活（图3）。因此乳糖酶的最适反应温度为47℃。

乳糖酶活性在35℃和40℃具有较好的稳定性，保温80 min，相对酶活仍保持60%以上。45℃稳定性下降，50℃稳定性快速下降，处理20 min降至最高酶活的50%以下（48.6%），40 min酶活仅为最高酶活的31.1%。说明该酶对热敏感（图4）。

2.4 XL-B36乳糖酶最适pH与pH稳定性

测定酶在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0的活性变化，以最高酶活为100%计算不同pH条件下的相对酶活。结果表明乳糖酶酶活在pH 5 ～ 10范围内为单峰曲线变化，最适pH为7.0（图5）。pH 4.0时检测不到酶活性，在5.0 ～ 8.0 范围内比较稳定（图6）。

2.5 金属离子和EDTA对乳糖酶活性的影响

Mn2+、Mg2+、Na+对酶活有明显的激活作用，Ca2+和Zn2+对酶活具有抑制作用，Cu2+和EDTA对乳糖酶活具有完全抑制作用（表1）。

3 讨论与结论

酵母菌是目前工业化生产乳糖酶的主要菌种资源。本研究从传统雪莲菌发酵乳中分离到一株产乳糖酶的酵母菌，克隆该菌的18S rDNA序列，序列全长1 690 bp，BLAST显示该菌株在进化关系上与克鲁维酵母属聚成一族，鉴定为马克斯克鲁维酵母 （XL-B36）。XL-B36乳糖酶最适反应温度为47℃，之后随温度升高乳糖酶活性快速下降，至57℃已检测不到酶活；该酶在35～40℃有较强的稳定性，高于45℃稳定性快速下降。XL-B36乳糖酶最适pH为7.0，在5.0～8.0范围内比较稳定。金属离子Mn2+、Mg2+、Na+对酶活有明显的激活作用，Ca2+和Zn2+对酶活具有抑制作用，Cu2+和EDTA对乳糖酶活性具有完全抑制作用。

金属离子对酶活具有调节作用，谢毅等[12]的研究表明，高浓度金属离子对乳酸克鲁维酵母乳糖酶活性具有抑制作用，Ca2+对酶的抑制可以被磷酸盐、脱脂乳以及Mg2+、Mn2+所恢复。母智森[13]研究发现分离自乳制品的马克斯克鲁维酵母STK-1-1所产乳糖酶最适pH为6.5，酶的最适作用温度范围为35～45℃，Cu2+、Ca2+对酶的活力有抑制作用，K+、Na+、Mg2+对酶有激活作用。XL-B36与STK-1-1所产的乳糖酶相比，最适pH略有不同（6.5和7.0），最适温度范围和金属离子对酶活的影响基本相同。李文婷等[2]研究了凝结芽孢杆菌RY237 β-半乳糖苷酶酶学性能，其最适反应温度和最适pH值分别为50℃和6.0，金属离子Ca2+、K+、Zn2+、Mn2+、Na+、Mg2+对酶活具有抑制作用，Cu2+对酶活具有完全抑制作用，而EDTA对酶活具有激活作用。李淑娟[14]研究发现，黑曲霉乳糖酶DL116酶促反应最适温度为60℃，最适pH 3.2～4.0，该酶在pH 2.5～9.0范围较稳定，在pH 7.5～9.0处理2 d仍保持最大酶活的94%以上，表明该酶具有很好的耐碱性。不同种类微生物产乳糖酶性能有很大差异，是乳糖酶开发应用的重要理论依据。本研究马克斯克鲁维酵母乳糖酶最适pH值为7.0，最适作用温度范围为35～45℃，适宜商业化应用。后续将研究乳糖酶代谢调控机制。

参 考 文 献：

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