内部沸腾法优化螺旋藻多糖提取工艺研究

材料，采用内部沸腾法提取螺旋藻多糖，研究乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间对螺旋藻多糖提取效果的影响，旨在为螺旋藻多糖的提取提供简便、快速的方法，同时为其多糖进一步分离纯化提供技术支撑.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

极大螺旋藻粉末（由甘肃凯源微藻中心提供）；无水乙醇、浓硫酸、苯酚、葡萄糖均为分析纯.

1.2 仪器与设备

722型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；DKB-501超级恒温水浴锅（扬州市三发电子有限公司）；DD-5M立式大容器离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；PL203电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）.

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的制作

准确称取100 mg葡萄糖，蒸馏水定容至1 000 mL，混匀后，分别吸取0.2，0.4、0.6，0.8，1.0 mL于试管中，加水补足至2 mL，各加入6%苯酚1mL，浓硫酸5 mL.混匀后静置，待冷却后在490 nm处测定吸光值，以葡萄糖含量X（μg）为横坐标，以吸光值Y为纵坐标绘制标准曲线，计算得回归方程为：Y=0.0073X+0.0366，R2=0.9728.

1.3.2 内部沸腾法提取螺旋藻多糖

称取0.5 g螺旋藻粉末，加入一定量一定浓度的乙醇均匀润湿20 min，使其充分进入物料内部后，按照一定比例加入一定温度热水.提取一段时间后，2000 r/min离心5 min，测上清液中多糖含量，计算多糖得率.

（1）乙醇浓度对螺旋藻多糖提取效果的影响

称取5份螺旋藻粉末各1 g，分别加入不同浓度的乙醇（10%，20%，30%，40%，50%）5 mL，充分润湿20 min后，按照料液比1∶14（g/mL）比例加入80 ℃热水.在恒温水浴锅中解析3 min后，2000 r/min离心5 min，测上清液中多糖含量，计算多糖得率.

（2）料液比对螺旋藻多糖提取效果的影响

称取5份螺旋藻粉末各1 g，加入20%乙醇各5 mL，充分润湿20 min后，按照不同料液比（1∶10，1∶12，1∶14，1∶16，1∶18（g/mL）加入80 ℃热水.在恒温水浴锅中解析3 min后，2000 r/min离心5 min，测上清液中多糖含量，计算多糖得率.

（3）提取温度对螺旋藻多糖提取效果的影响

称取5份螺旋藻粉末各1 g，加入20%乙醇各5 mL，充分润湿20 min后，按照料液比1∶14比例加入不同溫度（60，70，80，90，100 ℃）的热水.在恒温水浴锅中解析3 min后，2000 r/min离心5 min，测上清液中多糖含量，计算多糖得率.

（4）提取时间对螺旋藻多糖提取效果的影响

称取5份螺旋藻粉末各1 g，加入20%乙醇各5 mL，充分润湿20 min后，按照料液比1∶14比例加入80 ℃的热水.在不同时间（1，3，5，7，9 min）解析，2000 r/min离心5 min，测上清液中多糖含量，计算多糖得率.

1.3.3 正交试验设计

在单因素基础上，根据结果对其条件进行正交设计优化，获得最佳的提取条件.

1.3.4 多糖得率计算

将制备的多糖样品溶液按照1.3.1方法进行测定，计算公式如下：

R=X×V2×NV1×M.

式中，R为螺旋藻多糖得率%，X为为螺旋藻多糖的含量（μg），M为螺旋藻质量（g），V1为加入反应体系中多糖提取液体积（mL），V2为制备的多糖提取液体积（mL），N为稀释倍数.

1.3.5 内部沸腾法与其他提取方法的比较

将内部沸腾法在最优条件下提取的多糖得率与超声波辅助、传统热水浸提、微波辅助方法相比较.

2 结果与分析

2.1 内部沸腾法提取螺旋藻多糖的单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对螺旋藻多糖得率的影响

由图1可知，随着乙醇浓度的增加，螺旋藻多糖得率逐渐增大，在乙醇浓度为40%时达到最大值，之后呈下降趋势.原因可能是低浓度的乙醇使物料内部沸腾强度弱，多糖得率较低；而多糖在高浓度乙醇中溶解性较差.因此，螺旋藻多糖得率的最佳乙醇浓度为40%左右.

2.1.2 料液比对螺旋藻多糖得率的影响

由图2可知，随着料液比的增加，多糖得率也随之增加，当料液比大于1∶14（g/mL），得率反而开始下降.料液比太高或太低均会影响多糖得率.料液比较低时，细胞内外多糖浓度差异较低[9]，提取不充分，不利于细胞中多糖的溶出，从而降低多糖的得率.料液比太高，导致提取液中多糖浓度较低，且后续处理过程工作量较大，增加工作时间和成本.因此，1∶14（g/mL）为螺旋藻多糖得率最佳的料液比.

2.1.3 提取温度对多糖得率的影响

由图3可知，随着温度的升高，螺旋藻多糖得率呈现先上升后下降的趋势，原因可能是提取温度较低时，多糖在提取过程中内部扩散较慢，溶解不充分，提取效果较差.随着温度升高，内部乙醇沸腾剧烈，当其速度达到一定程度时，乙醇挥发较快，导致螺旋藻多糖提取不完全.因此，螺旋藻多糖提取温度选择80 ℃.

2.1.4 提取时间对螺旋藻多糖得率的影响

由图4可知，随着提取时间的延长，螺旋藻多糖的内部沸腾提取速度很快，当提取时间为3 min时，螺旋藻多糖的得率最大，提取时间延长，非糖类物质溶出，使多糖得率下降.所以，螺旋藻多糖得率最佳解析时间为3 min.

2.2 内部沸腾法提取多糖的正交试验

试验以乙醇浓度%（A）、料液比（g/mL）（B）温度℃（C）、解析时间min（D）作为正交试验的5个因素，以多糖得率为分析指标，进行16组正交试验L9（34）.见表1和表2.

由表2和表3可知，各因素对螺旋藻多糖得率的影响依次为：A（乙醇浓度）>D（时间）> C（温度）>B（料液比）.影响螺旋藻多糖提取的因素P值均大于0.05，该取值范围差异不显著.方差分析中F值结果与表2中极差分析结果吻合，即A（乙醇浓度）相比其他因素来说，对多糖提取效果的影响较大，说明按照乙醇浓度参数对物料进行内部渗透，使多糖最大量的溶出，提高得率.最佳提取工艺条件为：A2B2C2D3，即乙醇浓度40%，料液比1∶14（g/mL），提取温度80 ℃，提取时间5 min.在此最佳条件下，进行验证性实验，测得螺旋藻多糖平均得率8.92%，说明正交试验设计获得的工艺条件是合理的.

2.3 内部沸腾法与其他提取方法的比较

内部沸腾法与超声波法、热水浸提、微波法相比，螺旋藻多糖提取效果差异显著（P<0.05）.内部沸腾和微波法提取多糖所需时间较短，热水提取时间最长.微波和超声波均需专门设备才可进行，内部沸腾法无需特殊设备，操作简便.因此，内部沸腾方法省时、简单、成本较低.

3 结论

本试验采用内部沸腾法对螺旋藻多糖进行提取，采用单因素和正交试验优化获得了多糖提取的最佳条件：乙醇浓度40%，料液比1∶14（g/mL），提取温度80 ℃，提取时间5 min，该条件下多糖得率8.92%.内部沸腾法与其他提取方法相比，具有操作简单、低耗能、回收率较高等优点，说明此法为提取螺旋藻多糖提供了一种高效、快速的提取方法，为多糖进一步分离纯化奠定基础，对螺旋藻多糖在食品和医药领域的深加工，具有一定的现实意义.

参考文献

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编辑：琳莉

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