金耳胞外多糖体外抗氧化作用研究

对金耳(Tremella aurantialba)胞外多糖抗氧化作用进行研究，结果发现金耳胞外多糖能显著地抑制H2O2诱导的红细胞溶血，降低肝细胞的自氧化与诱导氧化产生的丙二醛（MDA），并能抑制氧化引起的肝线粒体肿胀度。

金耳； 胞外多糖； 抗氧化

S567.34A

金耳 (Tremella aurantialba) 为银耳目、银耳科、银耳属的一种名贵珍稀的食药用菌。多糖作为药物的研究始于20世纪40年代。50年代末，由于发现了真菌多糖的抗癌作用，促使人们更加系统深入地开展多糖研究。瞿伟菁等报道了金耳胞内多糖具有降血糖活性［1-3］，而胞外多糖的生理活性却未见报道。本实验研究了金耳胞外多糖（Extracellular polysaccharide of Tremella aurantialba,TEP）的体外抗氧化作用，为进一步开发利用金耳的胞外多糖提供科学依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株

金耳(Tremella aurantialba)菌株由中华全国供销总社昆明食用菌研究所刘正南实验室提供。

1.1.2试剂

三氯乙酸、硫代巴比妥酸、过氧化氢、抗坏血酸和硫酸亚铁等均为国产分析纯试剂。

1.1.3实验动物

雄性SD大鼠购于上海西普尔－必凯公司（许可证号：沪动合证字152号)。

1.2方法

1.2.1金耳胞外多糖制备

50 L通气搅拌反应器发酵培养的金耳发酵液经过滤、离心除去菌丝体后，滤液中加3%NaOH 40 ℃水解4 h，用2 M H2SO4调节 pH至10～11过夜。取水解液，用0.1μm膜微滤，滤液用MW5000膜截留，截留液用蒸馏水洗数次至pH中性。浓缩后加入4倍酒精沉淀，并用无水乙醇、乙醚洗涤数次，真空干燥得褐色粉末状金耳胞外多糖粗品。

1.2.2金耳胞外多糖对H2O2诱导红细胞氧化溶血的测定［5］

2只大鼠尾静脉采血，加入抗凝剂，3000×g离心5 min得红细胞，冷生理盐水洗3次，制成0.5%红细胞悬浮液。各组均取红细胞悬浮液0.5 mL，每组5个平行，加不同浓度（0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的金耳胞外多糖 0.1 mL，最后加入300 mmol/L H2O20.1 mL启动反应，37 ℃作用1 h，3000×g离心5 min，生理盐水稀释6倍，取上清液于415 nm处测定吸光度(OD)。

1.2.3抗脂质过氧化的测定［6］

迅速取上述1.2.2.1取血后大鼠的肝，用冷生理盐水洗净，冰浴下匀浆，制成10%的肝细胞悬浮液，100×g离心10 min，去除离心后的沉淀得匀浆液。各组取肝匀浆液1 mL, 每组4个平行, 加不同浓度的（0.03、0.3、0.5、0.7 mg/mL）金耳胞外多糖0.1 mL，37 ℃作用1 h, 间或摇晃。加入1 mL 20%三氯乙酸 (TCA)结束反应，再加入1 mL 0.8%硫代巴比妥酸 (TBA),于沸水浴中显色15 min，冷却后3000×g离心10 min，取上清液于532 nm处比色。

抑制率（%）=（MDAcMDAs）/ MDAc×100%

MDAc和MDAs分别为对照处理和样品

(TEP)处理的OD值。

1.2.33对Fe2+VitC诱导大鼠肝脂质过氧化的测定

各组取肝匀浆液1 mL, 每组4个平行, 加不同浓度的（0.03、0.3、0.5、0.7 mg/mL）金耳胞外多糖0.1 mL，再分别加入抗坏血酸和FeSO4 (终浓度分别为1 mmol/L和0.1 mmol/L)。37 ℃作用1 h, 间或摇晃。加入1 mL 20%TCA结束反应，再加入1 mL 0.8%TBA,于沸水浴中显色15 min，冷却后3000×g离心10 min，取上清液于532 nm处比色，抑制率计算同上。

1.2.4肝线粒体肿胀度的测定［7］

取10%的肝组织匀浆液10 mL，4 ℃ 3000×g离心10 min，弃沉淀，取上清液10000×g离心15 min，沉淀物为线粒体。用生理盐水配制成吸光值为0.5~0.6的肝线粒体悬浮液备用，由FeSO₄ VitC产生OH，1.0 mL悬浮液各加入不同浓度（0.4、0.8、1.0 mg/mL）金耳胞外多糖100μL，1 mmol/L FeSO₄ 50 μL和1 mmol/LVitC 50 μL，在520 nm处测定不同反应时间（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min）的吸光值。

2 结果

2.1金耳胞外多糖对H₂O₂诱导红细胞氧化溶血的作用

金耳胞外多糖浓度在0.8 mg/mL时能抑制H₂O₂诱导的大鼠红细胞氧化溶血，浓度1.0 mg/mL时的抑制率达到33.5%（表1），表明金耳胞外多糖浓度大于0.8 mg/mL时可抑制氧化损伤，保护红细胞膜。

2.2金耳胞外多糖对大鼠肝组织自发性脂质过氧化的影响金耳胞外多糖对大鼠肝组织自发性脂质过氧化的结果如表2所示，浓度为0.5和0.7 mg/mL的金耳胞外多糖组的大鼠肝组织MDA生成量均显著低于对照组(P<0.01)；抑制率分别达到41.1%和50.9%。

2.3金耳胞外多糖对Fe²⁺VitC诱导大鼠肝脂质过氧化的影响

由表3可知，金耳胞外多糖各组大鼠肝组织中的MDA生成量均显著低于Fe²⁺VitC对照组(P<0.05 、P<0.01)。表明金耳胞外多糖可抑制Fe2+VitC诱导的脂质过氧化作用，但没有明显的剂量－效应关系。

2.4金耳胞外多糖对肝线粒体肿胀度的影响

线粒体氧化损伤后发生肿胀，表现为其悬浑浊度下降，在520 nm处吸收值降低；抑制肿胀，则使线粒体在520 nm处吸收值趋于稳定。由实验结果(图1)表明，大鼠肝线粒体经VitC和Fe²⁺诱导后,模型组肿胀程度增加,随着反应时间的延长肿胀越明显。加入不同浓度的金耳胞外多糖后,在相同的时间里,线粒体的肿胀受到明显地抑制。

3 结论

自由基是带有不配对电子的原子、原子团或分子。自由基可引发生物膜的不饱和脂肪酸花生四烯酸过氧化，形成过氧化脂质(LPO)，丙二醛（MDA）即为LPO的降解产物［8］。自由基在体内引起各种生物学反应，如破坏生物膜等，导致体内的脏器受损。超氧阴离子自由基(O₂)、羟自由基(·OH)等含氧自由基称为氧自由基。其中·OH对细胞的危害最大，可直接损伤各种生物膜，导致多种疾病的发生［9］。

本研究发现金耳胞外多糖能显著地抑制H₂O₂诱导的红细胞溶血及显著降低肝匀浆的自氧化与诱导氧化产生的MDA，对于诱导氧化引起的肝线粒体肿胀度的改变亦有显著的抑制作用。以上结果提示，金耳胞外多糖具有较高的羟基自由基清除能力，对红细胞和组织细胞以及亚细胞膜性结构有保护作用，这可能是金耳胞外多糖防衰老、增强免疫等功能的药理基础，有待继续深入研究。

［1］ 毛述永，吕庆茂，瞿伟菁. 金耳多糖降血糖效应的研究［J］. 华东师范大学学报（自然科学版，生物学专辑）, 1997，74-77.

［2］ 张 雯，瞿伟菁. 复方金耳多糖对高血糖SD大鼠降糖效应的研究［J］. 华东师范大学学报（自然科学版，动物学专辑）, 1999，86-90.

［3］ 朱欣华，瞿伟菁，王煜非. 金耳菌丝体多糖对SD大鼠降血糖作用机制研究［J］. 华东师范大学学报(自然科学版,动物学专辑）, 1999, 102-105.

［4］ 邓云霞, 瞿伟菁, 曹群华, 等. 金耳胞外多糖的结构分析［J］. 中草药, 2005, 36(4): 497498.

［5］ 黄夏琴,蒋惠娣,徐 庆, 等. 紫珠草抗脂质过氧化作用的实验研究［J］. 中草药, 1998, 29(4):246-248.［6］ 蔡秀成,郭 英,陈秋丽. 芦荟的体外抗脂质过氧化作用［J］. 食品科学, 2001, 22(7):83-85.

［7］ 龚国清,刘同征,李立文, 等. 西红花酸的体外抗氧化作用的研究［J］. 中国药科大学学报, 2001, 32(4):306-309.

［8］ 郑荣梁. 自由基生物学［M］.北京：高等教育出版社,1991: 216.

［9］ 赵云涛,国兴明,李付振. 金樱子多糖的抗氧化作用［J］.生物学杂志, 2003, 20(2):23-24.

唐庆九

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