双藤痹痛凝胶膏剂对胶原诱导性关节炎模型大鼠血浆炎性因子和滑膜组织相关因子的影响

材料

1.1 动物

雄性Wistar大鼠40只，SPF级，鼠龄10～12周龄，体质量（220±20）g，上海斯莱克实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（沪）2007-0005。饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级实验室，光暗周期12 h/12 h，温度（25.0±0.5）℃，相对湿度50%～70%，大鼠适应性喂养1周后开始实验。

1.2 药物

双藤痹痛凝胶膏剂（由雷公藤、青风藤、穿山龙、甘草等组成，每贴8 cm×12 cm，含雷公藤甲素 246.59 μg，含青藤碱155.89 mg），福建中医药大学药学院，批号20140310；空白凝胶膏剂（NP700、卡波姆等水溶性高分子材料），福建中医药大学药学院，批号20140310-1。

1.3 主要试剂与仪器

完全弗氏佐剂（CFA）、不完全弗氏佐剂（IFA）、牛Ⅱ型胶原，美国Chondrex公司；TLR4、髓样分化因子88（MyD88）和NF-κB一抗，Cell Signaling Technology；Trizol试剂（Invitrogen），RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒（Fermentas），DreamTaqTM Green PCR Master Mix（2X）试剂盒（Fermentas）。CS-1EAS型电子天平（北京市菲姆斯科技开发公司），TD5A-WS台式低速离心机（湘仪离心机仪器有限公司），C1000TM Thermal cycler PCR仪（美国Bio-RAD公司），ChemiDocTM XRS+核酸成像系统（美国Bio-RAD公司）。

2 实验方法

2.1 造模

参考文献[2-3]方法建立CIA模型。将牛Ⅱ型胶原（2 mg/mL）与CFA等体积混合，研磨制成胶原乳剂。于大鼠尾部2 cm处皮下注射胶原乳剂0.2 mL/只，并于第7日在大鼠尾部3 cm处皮下注射牛Ⅱ型胶原与IFA等体积的混合乳液0.1 mL/只，进行2次免疫。将关节炎指数评分>1的大鼠纳入实验。

2.2 关节炎指数测定

大鼠初次免疫后第4日开始（每隔3 d）观察大鼠四肢关节病变程度。病变程度按0～4级评分法[1]评分，四肢关节炎指数之和代表每只大鼠关节炎指数，积分越高，关节症状越严重，最高分值为16分。评分标准：0分，关节正常无红肿；1分，趾关节红肿；2分，趾关节和足趾肿胀；3分，踝关节以下的足爪肿胀；4分，包括踝关节在内的全部足爪肿胀、关节严重变形。

2.3 分组及给药

除正常组外，动物初次注射胶原乳剂后第2日开始，将双藤痹痛凝胶膏剂贴于大鼠背部固定，每日1次（同一部位），连续28 d。其中模型组为空白凝胶膏剂，大小2 cm×3 cm；双藤痹痛高、低剂量组分别给予3 cm×3 cm、1 cm×3 cm的双藤痹痛凝胶膏剂。

2.4 血浆与滑膜组织的采集与处理

大鼠于最后一次给药后，腹腔注射10%水合氯醛（1 mL/100 g）麻醉，腹主动脉取血，收集大鼠新鲜血液约6 mL，室温静置1 h，3000 r/min离心15 min，将上清液移至Eppendorf管分装，-20 ℃保存备用。

处死大鼠后取右膝关节，沿膝关节正中纵行切开皮肤，直至暴露以膝关节为中心约0.3 cm×0.3 cm 的区域，以有齿镊提起髌骨。沿髌骨上缘向下切割直至股骨，再分别沿髌骨两侧向下分离至胫骨，此时即打开了膝关节腔，可见由髌骨下缘向上有一层平滑光亮呈淡黄色的滑膜组织，用刀片完全剥离滑膜组织，并完整取下，投入液氮中保存，供指标检测。

2.5 ELISA检测血浆肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6含量

取适量血浆样本溶解后，根据TNF-α、IL-1β及IL-6试剂盒说明书的实验步骤加入样品、酶标偶合液、显色剂室温孵育，反应完全后加入终止液，于酶标仪波长450 nm处测定每孔的吸光度。

2.6 RT-PCR检测滑膜组织Toll样受体4、髓样分化因子88和核因子-κB的mRNA表达

采用Trizol两步法提取每只大鼠滑膜组织总RNA，每组10只。取总RNA 1 μg反转录成cDNA。反应体系20 μL，扩增条件为：95 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，退火40 s，72 ℃延伸40 s，35个循环，72 ℃延伸10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像分析系统进行观察及光密度扫描，以GAPDH基因为内参，各基因擴增条带的光密度值与各自内参的光密度值之比作为评价指标。引物序列见表1。

2.7 Western blot检测滑膜组织Toll样受体4、髓样分化因子88和核因子-κB的蛋白表达

滑膜组织加入RIPA裂解液后匀浆，10 000 r/min离心10 min，收集上清液，BCA法检测其蛋白浓度，20 μL上样，经SDS-PAGE电泳分离，电转至固相支持体PVDF膜上，分别加入一抗和二抗，发光试剂发光，成像。应用Bio-Rad软件对Western杂交蛋白区带进行积分光密度值分析。

3 统计学方法

采用SPSS18.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 一般变化

初次免疫1周后大鼠关节无红肿，活动无明显异常状态出现。随着时间的延长，造模组大鼠活动和进食量减少，毛发干枯，精神萎靡；后足趾关节开始出现红肿，逐步蔓延到尾部，少数可累及前肢，并且日趋严重，关节功能活动障碍，不能正常行走；双藤痹痛高、低剂量组大鼠上述症状明显缓解，且背部连续给药28 d未发现过敏反应及皮损现象。

4.2 双藤痹痛凝胶膏剂对模型大鼠关节炎指数的影响

初次免疫后模型组大鼠各时点关节炎指数明显升高；与模型组比较，第12日后双藤痹痛低剂量组大鼠关节炎指数明显降低（P<0.05，P<0.01）。结果见表2。

4.3 双藤痹痛凝胶膏剂对模型大鼠血浆肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6含量的影响

与正常组比较，模型组大鼠血浆TNF-α、IL-1β和IL-6含量显著升高（P<0.01）；与模型组比较，双藤痹痛高剂量组大鼠血浆TNF-α、IL-1β和IL-6含量明显降低（P<0.01），双藤痹痛低剂量组大鼠血浆IL-1β和IL-6含量明显降低（P<0.05，P<0.01），结果见表3。

注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

4.4 双藤痹痛凝胶膏剂对模型大鼠滑膜组织Toll样受体4、髓样分化因子88和核因子-κB mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠滑膜组织TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达均显著升高（P<0.01）；与模型组比较，双藤痹痛高剂量组大鼠滑膜组织TLR4、MyD88、NF-кB mRNA表达显著降低（P<0.01），双藤痹痛低剂量组大鼠滑膜组织TLR4、NF-кB mRNA表达显著降低（P<0.05，P<0.01），结果见图1。

4.5 双藤痹痛凝胶膏剂对模型大鼠滑膜组织Toll样受体4、髓样分化因子88和核因子-κB蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠滑膜组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白高度表达（P<0.01），阳性表达条带清晰；与模型组比较，双藤痹痛高剂量组大鼠滑膜组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达显著降低（P<0.01），双藤痹痛低剂量组大鼠滑膜组织MyD88、NF-κB蛋白表达显著降低（P<0.05，P<0.01）。结果见图2。

图2 各组大鼠滑膜组织TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表达

5 讨论

TLRs在免疫系统中发挥着重要的作用，能识别外源性病原相关分子模式及内源性分子产生的组织损伤、炎症反应，通过跨膜结构将病原相关分子刺激信号转导入细胞内，产生复杂的级联信号反应，导致NF-κB等转录因子活化，介导IL-1、IL-6及TNF-α等炎性介质基因的表达，引起相应炎症介质的合成和释放，进而趋化和激活中性粒细胞，活化淋巴细胞，启动先天和获得性免疫；内源性TLR配体被称为损伤相关分子模式，包括活化细胞和坏死细胞释放的内源性分子及细胞外基质分子。多项研究表明，TLRs信号通路与RA的发病机理关系密切[4-5]。

NF-κB是一种常见的转录因子，炎症反应的核心调控因子。NF-κB由2类亚基形成同源或异源二聚体，最常见的亚基组成形式为p65/p50或p65/p65。正常情况下，细胞内外通路正、负反馈对NF-κB的活化精细调节使NF-κB的活化在适当水平[6]。NF-κB未被激活时分布在细胞浆中，可以被炎症因子（IL-1β、TNF-α等）、生长因子或趋化因子等激活，通过1个或多个信号途径使抑制性蛋白I-κB磷酸化、泛素化并进一步降解，使NF-κB与I-κB解离，移位至胞核，与DNA上启动子区域相应的靶基因位点结合，进而启动一系列免疫相关基因如前炎症介质（如IL-1β、TNF-α、IL-6等）及一些炎性相关酶类的转录程序，导致其表达增多，使大量炎性细胞浸润于炎症部位，从而引起或进一步加重体内炎症反应[7-8]。

有研究表明，NF-κB能促进滑膜细胞的增殖并抑制其凋亡，导致滑膜增生肥厚，加重关节组织结构的破坏[9]。RA患者滑膜组织NF-κB p65表达及活化水平均显著高于正常对照组，IL-1β mRNA表达水平也高于正常组，并与NF-κB的活化水平呈正相关[10]。另有研究显示，牛Ⅱ型胶原所致的CIA模型大鼠关节滑膜的NF-κB p65蛋白表达明显高于正常对照组[11]。本研究结果表明，双藤痹痛凝胶膏剂在一定剂量下可降低CIA大鼠血浆TNF-α、IL-1β及IL-6水平，降低CIA大鼠滑膜组织TLR4、MyD88、NF-κB的表达，提示双藤痹痛凝胶膏剂可能通过抑制炎症反应、调节滑膜组织TLR4/NF-κB信号通路相关靶点蛋白表达发挥抗炎作用。

已有研究表明，雷公藤内酯醇[12]、青藤碱[13]、穿山龙总皂苷[14]等均可抑制大鼠滑膜细胞增殖。双藤痹痛凝胶膏剂是由多味中药组成，含有成分较多，其作用机制可能与这些成分有关，有待今后进一步研究。

参考文献：

[1] 严国鸿，黄燕，李煌，等.双藤痹痛凝胶膏剂对胶原诱导性关节炎模型大鼠的作用[J].中药药理与临床，2014，30（1）：119-121.

[2] 郭江燕，高梓珊，姜姝姝，等.IL-17和NF-κB通路与类风湿性关节炎的相关性研究[J].长春中医药大学学报，2015，31（1）：193-194.

[3] 胡荫奇.风湿性疾病诊断治疗指南[M].北京：中国协和医科大学出版社，2006：84.

[4] MICHIAKI T. Toll-like receptor-a potent driving force behind rheumatoid arthritis[J]. J Clin Exp Hematopathol，2011，51（2）：77-92.

[5] TAKEDA K， AKIRA S. TLR singaling pathways[J]. Semin Immunol， 2004，16（1）：3-9.

[6] 郭江燕，高梓珊，姜姝姝，等.IL-17和NF-κB通路与类风湿性关节炎的相关性研究[J].长春中医药大学学报，2015，31（1）：192-194.

[7] HARHAJ E W， DIXIT V M. Deubiquitinases in the regulation of NF-kappa B signaling[J]. Cell Res，2011，21：22-39.

[8] SETHI G， SUNG B. AGGARWAL B. Nuclear factor-kappa B activation：from bench to bedside[J]. Exp Biol Med （Maywood），2008，233（1）：21-31.

[9] BAI S， LIU H， CHEN K H， et al. NF-kappaB-regulated expression of cellular FL IP protects rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from tumor necrosis factor alpha-mediated apoptosis[J]. Arthritis Rheum，2004，50（12）：3844-3855.

[10] 韓飞，尤欣，唐福林.核因子κB在类风湿关节炎滑膜组织中的表达与意义[J].中华风湿病学杂志，2004，8（3）：143-146.

[11] 庞学丰，王乾，吴燕红，等.寒痹康汤对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜细胞NF-κB表达的影响[J].风湿病与关节炎，2013，2（7）：32-34.

[12] 陈占昆，王宁，吕厚山.程序化细胞死亡因子 5过表达促进雷公藤内醇酯诱导的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡[J].北京大学学报：医学版，2008，40（6）：567-571.

[13] 方勇飞，王勇，周新，等.青藤碱对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞核因子κB信号转导的影响及其机制[J].中国临床康复，2005，9（7）：204-205.

[14] 高亚贤，王永为，郭亚春，等.穿山龙总皂苷对大鼠滑膜细胞株VEGF 与AP-1的影响[J].医药导报，2015，34（3）：285-289.

（收稿日期：2017-06-19）

（修回日期：2017-07-24；编辑：华强）

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