NMDA受体NR2B亚型基因对海马成年新生神经元形态发生的影响

摘要：目的研究NMDA受体NR2B亚型基因对海马成年新生颗粒细胞形态发生的影响。方法通过Creloxp重组酶系统构建NMDA受体NR2B亚型基因单细胞敲除模型。运用Neurolucida软件系统对野生型、NR2B基因敲除成年新生神经元进行形态重建，观察树突长度、树突复杂度以及棘突的变化。结果NR2B基因敲除成年新生神经元外形与WT神经元相似，树突长度接近，棘突减少。Sholl分析显示在以胞体为中心，距胞体不同距离的树突亚区域内，树突复杂性（树突交叉）减低，与此同时棘突分布密度减低（P<0.05）。结论海马成年新生颗粒神经元NR2B基因敲除对新生细胞树突长度影响甚微，但降低了树突复杂性，减少棘突形成，从而导致了功能性整合入海马特定神经信息网络的障碍。

关键词：成年神经发生；NMDA受体；NR2B亚型；形态发生

中图分类号：R392文献标识码：A文章编号：16721349（2012）12149503

成年神经发生（adultneurogenesis）在哺乳动物前脑持续存在，脑卒中、癫痫、创伤、环境刺激、情绪等因素均会影响成年后神经发生。行为学证据表明[1，2]，海马成年神经发生对于海马某些形式的学习、记忆以及情绪调节非常重要。成年新生神经元，具有长时程增强（longtermpotention，LTP）、动作电位诱发阈值降低、兴奋性增高等神经活性[3]。海马癫痫为神经兴奋性增加的最常见的形式之一，也可以诱发增加成年神经发生：在红藻氨酸注射诱发的癫痫模型[4]和癫痫的点燃激发模型均能观察到神经发生增加[5]。而在匹罗卡品诱发癫痫模型中，通过阻滞成年神经发生可以减少自发性复发性癫痫的发生[6]。因此，海马神经活性与成年神经发生之间存在着紧密的双向联系。

而NMDA受体依赖型的长时程增强是成年神经发生中神经活性、突触可塑性的重要证据，被认为是海马空间记忆的神经生物机制[7，8]。Ge等[3]研究发现，LTP是依赖于NMDA受体NR2B亚型基因的。因此，研究NMDA受体NR2B亚型基因对海马成年新生神经元发育成熟过程的影响，对于进一步探讨新生神经元的功能、神经活性、海马依赖的学习和记忆分子机制，以及未来可能的治疗策略，均具有非常重要意义。

本研究建立海马成年新生神经元NR2B基因敲除模型，观察NR2B基因敲除对成年新生神经元细胞形态、树突、棘突发育等的影响，进一步阐明NR2B基因在海马成年发生中的重要作用。

1材料与方法

1.1实验动物与分组经基因型鉴定后的清洁级成年健康NR2Bfl/fl转基因小鼠[9]（NR2B基因被loxp序列标记），C57BL/6野生型小鼠（wildtype，WT），同济医学院实验动物中心提供，体重20g～30g。NR2Bfl/fl转基因小鼠为实验组，C57BL/6小鼠为WT对照组。

1.2实验方法

1.2.1海马成年新生神经元NR2B基因敲除模型制作运用逆转录病毒基因标记技术，利用Creloxp重组酶体系，建立海马成年新生神经元单细胞NR2B基因敲除模型。本实验采用的是逆转录病毒载体MoloneyRSVpGFP：T2aCre（Dr.WolfgangKelsch馈赠）：带有一个来源于Roussarcomavirus内源性启动子RSV；pGFP与Cre基因由T2a序列连接，T2a序列保证了GFP基因与Cre基因的同时高效率表达[10]。

当逆转录病毒注射入成年神经发生部位时（海马齿状回颗粒下层），感染带有loxp打靶基因NR2B的神经祖细胞/母细胞，当Cre酶激活时，Creloxp重组酶系统工作从而产生海马新生单细胞NR2B基因敲除模型。当Cre在NR2Bfl/fl转基因小鼠海马齿状回表达后，GFP+阳性神经元为NR2B基因敲除海马新生神经元（ΔNR2B神经元）。野生型小鼠作为对照。

1.2.2小鼠海马齿状回立体定位注射Isofluran（Baxter）吸入麻醉（0.5mL/100g），固定小鼠于立体定位仪上（Kopf921，德国）。麻醉以及手术期间用加热毯持续加热，保持体温37℃～37.5℃。根据海马齿状回立体坐标定位（前囟向后2mm，旁开1.3mm，深1.8mm），用牙科钻钻孔，在双侧海马各注射1mL病毒（RSVpalmGFP：T2aCre）。

1.2.3组织漂片制作和免疫组织化学染色在逆转录病毒注射后17d予以经心脏4%多聚甲醛灌注取脑。组织漂片（150μm）于3%H2O2室温处理20min～25min。2%TritonX100室温破膜1h。5%BAS+0.2%TritonX100室温封闭1h。1抗工作液4度孵育24h（兔抗EGFP1∶1000，Invitrogen）。生物素标记的抗兔二抗（1∶500，VectorLaboratories），室温孵育4h。辣根酶标记的工作液A+B（VectorLaboratoriesBurlingame，CA，USA）：各1∶500+1%TritonX100用1×PBS稀释，孵育2h～3h。滴加DAB工作液200μL（5mg/mLDAB）+800μLPBS+0.67μL30%H2O2，显色满意后以PBS终止反应。各主要步骤间均以1×PBS漂洗3次～4次。

1.2.4海马成年新生神经元形态重建采用OlympusBX51显微镜系统和Neurolucida（MBFBioscience）软件分析系统对DAB标记的GFP阳性细胞进行胞体、树突、棘突重建。Sholl分析[11]用来累计计算以胞体为中心，每间隔30μm直径范围内棘突（protrusions）密度和树突交叉（dendriticintersections）的数目，后者反映了树突复杂度（dendriticcomplexity）。

3讨论

NMDA受体是兴奋性谷氨酸离子通道，介导中枢神经系统的信号传导。它由2个功能亚单位NR1和两个调节亚单位NR2（NR2AD）组成。在胚胎期内，NR2B表达非常广泛；但在成年后NR2B表达局限于包括海马、皮层的前脑结构。NR2B全脑敲除模型或C末端截断模型均导致动物在出生立即死亡[13，14]。NR2B基因在胚胎期重点表达、决定胚胎期动物存活的特点，以及特异性的发育分布模式，引起了广泛的关注。

本课题组前期研究工作中发现，NMDA受体NR2B亚型基因在起源于侧脑室旁室管膜下区（subventricularzone）的嗅球成年新生神经元的生存，整合以及兴奋性神经网络的功能维持中起着至关重要的作用。因此，发源于海马齿状回颗粒下层的成年新生神经元是否遵循同样的生存规律值得深入探讨。

结果显示，海马成年新生神经元的树突生长并不依赖于NMDA受体NR2B亚型基因。表现为在新生神经元快速分化整合到原有神经网络的阶段，ΔNR2B和WT神经元均生成了形态类似、长度相近的树突。而近期研究结果亦有类似发现，NR2B基因对海马成年新生神经元和大脑Barrel皮层卫星细胞形态发育的影响不大，ΔNR2B神经元形成了与WT神经元相似长度的树突[15]。与此同时，另外两篇研究报道显示，NMDA受体的另一功能亚型NR1对大脑皮层锥体神经元的树突发生影响不大[16，17]。因此，NMDA受体，包括NR2B亚型在内，对神经元的树突长度影响甚微[15]。

然而，成年新生神经元NMDA受体NR2B亚型基因敲除显著减少棘突发生，表现在总棘突数目的下降；Sholl分析进一步显示，在树突的某些亚区域，NR2B依赖型的棘突发生减少尤为明显。由于棘突的形成在空间上受树突分枝的限制，早期的树突发展的模式变化可以限制后期棘突的分布[12]；因此，当局部区域树突复杂性减低之后，会在相应的区域影响棘突的发育。在我们的观察中的确观察到类似的NR2B依赖的功能亚区。

Ultanir等[16]同样在NR1基因敲除的皮层锥体细胞中观察到棘突密度下降。这些类似的改变可能来自于NR1和NR2B亚单位共同作用于同样的突触后结构，并影响下游可能的级联信号反应。离体组织培养研究发现[1820]，树突上的棘突发生可以被谷氨酸或者LTP诱发的刺激以一种NMDA受体依赖的方式激发。研究进一步指出，棘突的发生先于突触的形成，新发生的棘突更倾向于与原有的突触相关联，从而形成多突触结构[21]。如果该假设成立，那么NMDA受体信号通道可能在维持突触的稳定性中的作用更为关键。Alvarez等[22]在体外细胞培养的研究中，通过SiRNA介导的NR1基因敲除，同样引起了棘突密度减低以及棘突失稳。近期在对海马CA3区锥体细胞研究发现，NR2B缺失会影响Actin细胞骨架蛋白的稳定性和动力学特性，而Actin是树突棘突上最主要的细胞骨架成分，因此，该研究认为NR2B与突触后巨分子复合物的互动是影响棘突稳定性的一个重要因素[23]。

Espinosa等[15]同时观察到树突发生模式的变化，例如海马新生NR2B缺陷神经元形成多分支树突；大脑皮层第4层Barrel皮层的星形兴奋性神经元将其突触延伸至毗邻的Barrel，与此同时，WT神经元树突延伸仅局限于一个Barrel。胚胎期NR2B和NR1基因敲除[13，24]，以及皮层特异性NR1基因敲除能引起皮层Barrel的缺失[16]。这些模式的改变可能来源于NMDA受体失活之后所相关联的下游的级联反应的阻滞[24]。本研究中没有观察到类似的树突发生模式的改变，尚需更进一步完善的研究。

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