牛病毒性腹泻病毒与宿主细胞的相互作用研究

摘要：自１９４６年Ｏｌａｆｓｏｎ等首次在美国纽约州发现牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）以来，该病毒在世界各地广泛流行和传播，尤其对一些畜牧业发达国家的奶业和牛肉业造成了巨大损失。了解牛病毒性腹泻病的致病机理，研制出更加安全可靠有效的疫苗，对控制该病的发生和蔓延尤为重要。对BVDV的病原学、生物学特性以及对宿主细胞的相互作用等进行了阐述，以期为ＢＶＤＶ的预防及治疗奠定基础。

关键词：牛病毒性腹泻病毒（BVDV）；分子生物学；细胞生物学；宿主细胞

中图分类号：Ｓ８５２．６５＋３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）08－1519-05

牛病毒性腹泻病（Ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ，ＢＶＤ）是由牛病毒性腹泻病毒（Ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ，ＢＶＤＶ）引起的一种以感染牛为主的疾病，该病呈世界性分布，属于黄病毒科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）瘟病毒属（Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）［１］。ＢＶＤＶ感染动物机体后，可以引起动物的生殖系统、呼吸系统、胃肠系统、血液循环、免疫系统、淋巴细胞、肌肉与骨骼系统、皮肤、中枢神经等诸多系统产生相应的病理学变化［２］。由于该病分布广泛，存在于大多数养牛业发达的国家，给世界养牛业造成了巨大的损失［３］。所以尽快研究清楚牛病毒性腹泻病的致病机理，为研制出更加安全、可靠、有效的疫苗，以控制该病的发生和蔓延尤为重要。本研究主要就ＢＶＤＶ的病原学特性、生物学特性以及细胞生物学，尤其是病毒感染后对宿主细胞和免疫相关细胞因子的表达影响做一概述。

１ＢＶＤＶ的病原学特性

１．１ＢＶＤＶ概述

ＢＶＤＶ是黄病毒科瘟病毒属的代表种。病毒粒子略呈圆形，但也常呈变形性。有囊膜，病毒表面有明显的纤突。病毒粒子直径 ５０～８０ ｎｍ。ＲＮＡ 核心直径为 ２０ ｎｍ±４ ｎｍ。病毒在细胞浆内复制，以出芽方式成熟。病毒核酸为线性单股正链 ＲＮＡ。ＢＶＤＶⅠ型基因组全长为 １２ ５７３ ｎｔ，ＢＶＤＶⅡ 型基因组全长为１２ ２５５ ｎｔ，（Ｇ＋Ｃ）ｍｏｌ％都为４５，编码区占 ９５％。病毒基因组只有一个开放阅读框架（Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ，ＯＲＦ），编码一个由近４ ０００ 个氨基酸组成的多聚蛋白，多聚蛋白由细胞和病毒基因编码的蛋白酶在翻译的同时或翻译后加工，至少生成 １１种成熟的蛋白质，编码这11种蛋白质的基因在基因组中的相对位置为 ５′-Ｎｐｒｏ（Ｐ２０）-Ｃ（Ｐ１４）-Ｅ０（ｇＰ４８）-Ｅ１ （ｇＰ２５）-Ｅ２（ｇＰ５３ Ｐ７-ＮＳ２-３（Ｐ１２５）-ＮＳ４Ａ（Ｐ１０）-ＮＳ４Ｂ（Ｐ３０）-ＮＳ５Ａ（Ｐ５８）-ＮＳ５Ｂ（Ｐ７５）-３′［４］。病毒粒子分子质量为 ６０×１０６ ｕ，在蔗糖中的浮密度为 １．１２～１．１３ ｇ／ｃｍ３，沉降系数 Ｓ２０ｗ为 １４０［５］。

１．２ＢＶＤＶ的培养特性

牛病毒性腹泻病毒可用胎牛肾脏细胞、脾细胞、睾丸细胞、肌肉细胞、鼻甲骨细胞，气管、肺、皮肤等组织细胞进行培养。常用的是胎牛肾、鼻甲原代细胞或二倍体细胞［６］。由于在白细胞、血小板、上皮细胞和成纤维细胞等细胞表面存在该病毒的受体ＣＤ４６，因此病毒主要通过黏膜（口腔、鼻、消化道和生殖道）侵入宿主体内，再经血液或淋巴液分布到全身组织器官［５］。

２ＢＶＤＶ的生物学特性

２．１ＢＶＤＶ的基因型特性

根据病毒基因组５′非翻译区（５′－ＵＴＲ）的序列将ＢＶＤＶ分成Ⅰ、Ⅱ两个基［７］，Ⅰ型还可进一步分为ＢＶＤＶ－１ａ、ＢＶＤＶ－１ｋ［８，９］。Ｊａｃｋｏｖａ等［１０］将 ＢＶＤＶⅠ型划分为 １３ 种亚型即Ⅰａ~Ⅰｍ，Ｍａｋｏｔｏ等［１１］分离到不同于已报道的 ＢＶＤＶ－Ⅰ型的2种新亚型Ⅰｎ和Ⅰｏ。Ｇｉａｎｇａｓｐｅｒｏ等［１２］根据 ＢＶＤＶ－Ⅱ型 ５′-ＮＴＲ二级结构差异将ＢＶＤＶ－Ⅱ划分为ＢＶＤV－Ⅱａ、ＢＶＤＶ－Ⅱｂ、ＢＶＤＶ－Ⅱｃ和 ＢＶＤＶ－Ⅱｄ ４ 个亚型；由于ＲＮＡ病毒的高突变性以及国际交流的日渐频繁，一定地区的ＢＶＤＶ基因新亚型还在不断变化［１３］。因此，ＢＶＤＶ基因亚型的研究对流行病学研究颇有裨益。在自然感染中基因Ⅰ型（６１％）比基因Ⅱ型（３２％）更为流行，且Ⅰｂ 比Ⅰａ更为流行［１４］。ＢＶＤＶ－Ⅰ普遍用于疫苗生产、诊断和研究，而 ＢＶＤＶ－Ⅱ ５′－ＵＴＲ 区缺乏ＰｓｔⅠ位点，且中和活性也不同于ＢＶＤＶ－Ⅰ，在持续感染（ＰＩ）牛、死于出血性综合征的急性ＢＶＤ牛中主要分离到ＢＶＤＶ－Ⅱ［１５］。

２．２ＢＶＤＶ的生物型特性

根据 ＢＶＤＶ 是否产生细胞病变（ＣＰＥ ）的生物学特性，把该病毒株分为非致细胞病变型（Ｎｏｎｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ，ＮＣＰ）和致细胞病变型（Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ，ＣＰ）［１６，１７］。致细胞病变型的出现是由病毒遗传物质的改变造成的，有插入、重复或重排等变化，发生于非结构蛋白ＮＳ２／３的基因编码区。非致细胞病变型的毒株可用于干扰作用，或鸡新城疫病毒强化试验及免疫荧光试验［６］。Ｒｉｄｐａｔｈ等［１８］通过建立牛淋巴样细胞系作为体外研究模型，并根据接种到淋巴样细胞和上皮细胞后的培养特征将ＢＶＤＶ分为３个生物型，即非致细胞病变型、致淋巴细胞病变型和致细胞病变型。笔者认为，目前针对ＢＶＤＶ的生物型划分概念应当更加严格地加以限定，它虽然在一定程度上反映了ＢＶＤＶ与宿主细胞，特别是与上皮细胞之间的关系，但不能明显地对ＢＶＤＶ的分子生物学特征作出界定：ＮＣＰ型ＢＶＤＶ强毒株急性感染导致血液中白细胞减少及坏死、凋亡的白细胞增多，推断ＮＣＰ型ＢＶＤＶ针对循环白细胞具有类似ＣＰ型ＢＶＤＶ的细胞损伤效应。同时笔者在试验中发现所用的标准ＮＣＰ型ＢＶＤＶ毒株出现不致细胞病变现象，是否是由于储存条件、储存年限、宿主细胞等原因所致，目前尚不清楚，有待于进一步研究，以揭示其中的转化机制。

３ＢＶＤＶ与宿主细胞的相互作用

研究发现ＢＶＤＶ感染的细胞类型较为广泛，对与免疫相关的细胞尤其易感，如Ｔ细胞、Ｂ细胞、抗原提呈细胞（Ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ，ＡＰＣ）， 作为主要 ＡＰＣｓ 的单核细胞（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、树突状细胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ，ＤＣ）、巨噬细胞（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）对ＢＶＤＶ均易感［１９－２１］。

３．１受体

ＢＶＤＶ受体包括ＣＤ４６［２２］和低密度脂蛋白（ＬＤＬ）受体［２３］，但随后Ｋｒｅｙ等［２４］的研究否定了ＬＤＬ作为ＢＶＤＶ受体的观点。进一步的研究表明ＢＶＤＶ结合ＣＤ４６后，ＣＤ４６在猪细胞上的表达和易感性增加，之后通过笼形蛋白依赖的内吞作用入侵细胞［２５，２６］。ＢＶＤＶ激活进入细胞的第一步可能涉及二硫键在病毒包膜蛋白质的重排［１８］。这期间发生的病毒入侵激活步骤的先决条件是病毒被膜需要结合酸依赖性内涵体膜，从而释放ＲＮＡ进入细胞质。Ｔｈｏｍａｓ等［２７］证实抗 ＣＤ４６ 抗体可以抑制 ＢＶＤＶ－Ⅰ和 ＢＶＤＶ－Ⅱ的易感性，表明ＣＤ４６是ＢＶＤＶ的广泛性受体。进一步研究表明牛ＣＤ４６表面的ＣＣＰ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＣＰ）是ＢＶＤＶ的结合位点，ＣＣＰ１是由两条反向平行的短肽序列组成，是ＢＶＤＶ的主要连接位点，交换两条短肽序列的顺序ＣＤ４６将丧失功能。测定ＣＤ４６的功能参数显示４个ＣＣＰｓ之间距离最短时发挥最主要的受体功能，通过在牛Ｃ４结合蛋白上插入１６个ＣＣＰｓ，以增加病毒结合区域和原生质膜之间的距离，结果显示对 ＢＶＤＶ的易感性影响很小。同时已知ＣＤ４６也是麻疹病毒、人疱疹病毒６型、人Ｂ组和Ｄ组腺病毒、化脓性链球菌和致病奈瑟氏菌的受体，但具体的结合位点有所区别。ＢＶＤＶ在进入受体细胞的过程中是否需要辅助因子和病毒糖蛋白等配体的参与，这些辅助因子的鉴定和病毒糖蛋白的确定将成为以后的研究重点，为彻底揭示ＢＶＤＶ与受体细胞之间的相互作用机理和过程奠定基础。

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