浅谈CRISPR-Cas9技术在现代医学前沿领域的相关应用

摘要：肺癌是人类常见的恶性肿瘤，发病率全球肿瘤中第一，发病率和死亡率也逐年增高。而最新研究表明通过CRISPR-Cas9技术可有效敲除基因中NFE2L1转录因子，中从而证实NFE2L1跨膜因子在肿瘤发生、胚胎发育中起着重要作用，CRISPR-Cas9技术为相关研究找到可重大突破口。G6PD缺乏症是最常见的一种遗传性酶缺乏病，全球约2亿人患有此病。有研究表明可通过CRISPR-Cas9对突变位点进行切割修复以达到治疗效果。由此可见，CRISPR-Cas9技术可通过对基因精确编辑来为诸多疾病治疗提供了更加广阔的思路。

关键词：CRISPR-Cas9技术   G6PD缺乏症   肺癌

近50年来，肺癌患者数量急剧上升，死亡率也明显增高。根据世界卫生组织国际癌症研究机构近日发布最新报告显示：2018年肺癌死亡人数高达180万人，占预计癌症死亡总人数的18.4%。我国G6PD缺乏症也是高发病，在我国各地患病率为0.2%～44.8%，全世界约2亿人患此病。近年来，CRISPR-Cas9技术与遗传病之间联系研究日益增多。我国于2016年也开展CRISPR-Cas9基因编辑技术治疗肺癌疾病的临床实验。本文对CRISPR-Cas9技术在肺癌及G6PD缺乏症的临床研究中的应用展开论述。

一、CRISPR-Cas9技术

（一）CRISPR-Cas9技术由来

生物公司EditasMedicine开发出了一种CRISPR-Cas9的基因治疗法，其可通过对DNA进行精确地序列剪切、作技术来治疗多种疾病。基因编辑是目前生命科学研究的一个热点，而CRISPR-Cas9是当今最流行的基因编辑工具，其在人类生物学、业及多个领域发挥着重要作用。2016年，中国科学家有望开展首个CRISPR-Cas9基因编辑临床实验 ，将由四川大学华西医院肿瘤学家卢铀教授及其研究小组带对利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除基因再回输入患者体内用以治疗肺癌。2017年，英国《自然通讯》杂志发表通过利用CRISPR-Cas9系统可拯救失明小鼠的重要遗传学研究成果，证实了CRISPR-Cas9在遗传病中的重要应用。

（二）CRISPR-Cas9技术原理

CRISPR-Cas9系统最早被发现于古生菌中，并且广泛存在于细菌中，是抵御外来遗传物质入侵的重要免疫机制。可将外源侵染物整合保存，该外源侵染物再次侵染细菌时，CRISPR及其相关蛋白会通过剪切破坏外源基因以保护细菌。CRISPR-Cas9由一系列成簇规律间隔的短回文重复序列组成。CRISPR-Cas9系统主要由在DNA分子上成线性排列的tracrRAN序列、as基因序列和CRISPR三个功能区构成。CRISPR-Cas9发生免疫系统原理为：Cas9蛋白可有效地对gRNA导介的特定位点进行编辑，将外源基因整合到自身基因中，具有核酸内切酶的作用。Cas9首先与一个gRNA结合并通过gRNA引导结合到DNA目标位点，识别的位点会受到DNA序列限制即Cas9识别靶序列后满足NGG序列。NGG序列也可称为PMA原型间隔序列毗邻基。这是CRISPR至关重要的一部分，PMA是一段高度保守的序列，Cas9只对位于PMA5’端附近的靶序列进行切割，在识别靶向DNA中起着重要作用。整合后的CRISPR序列首选转录为pre-crRNA再与tracrRNA形成复合物，并通过Rnase切割形成crRNA从而完成crRNA的转录加工。该过程中crRNA通过靶基因互补配对的方式來保持基因特异性。通过科学探究发现，人们可以利用Cas蛋白发挥核酸内切酶活性切断外源基因的机理，若除去Cas蛋白核酸内切酶活性，形成dCas蛋白，则可阻碍靶细胞转录以实现基因静默，从而对多项基因研究工作提供了渠道。

（三）CRISPR-Cas9技术展望

CISPR-Cas9使用起来简单，易于设计且成本低等优点，从而替代了以往生物学家利用的分子工具编辑基因组技术。分子具编辑基因组技术中有一种锌指核酸酶技术有望精确高效编辑基因，但其价格昂贵并未广泛使用。而CRISPR-Cas9却有着决定性的优势，因为该序列衍生的RNA可引导蛋白质结合到特定DNA片段，从而引起目标DNA上的双链断裂，简单高效。研究人员只需要订购RNA片段，花费明显降低，并且与锌指核酸酶技术相比，CRISPR-Cas9基因编辑技术的设计和构建难度明显降低，且CRISPR-Cas9可同时进行多靶编辑，靶向修饰率也大大提高。因此，CRISPR-Cas9技术被广泛应用于生物医学研究。

任何事物都有利弊CRISPR-Cas9技术也不例外。CRISPR-Cas9技术虽然被应用到世界各国众多科学研究中，与此同时它也有所弊端，即使sgRNA可以精确定位，Cas9蛋白可以精确识别RNA序列，但也会有失误的时候——脱靶。各项基因工程研究都避免不了脱靶现象，这影响了编辑效率，也会造成一定的风险。目前，虽然不能完全消除脱靶现象的存在，但可以通过优化sgRNA、提高Cas9蛋白自身特异性等方法降低脱靶率。虽然CRISPR-Cas9技术使用上有些阻碍，但依旧不可否认，CRISPR-Cas9技术为生物体研究和改造带来的巨大贡献。

二、CRISPR-Cas9技术在医学中应用

（一）G6PD缺乏症

CRISPR/Cas9 系统作为新一代基因编辑工具，其强大的基因编辑能力不仅在遗传性疾病研究中有所突破，并且在临床试验中也被积极展开应用，如杜氏肌营养不良，Crygc基因突变引发的白内障等疾病中的应用。目前，CRISPR-Cas9技术正在尝试应用于G6PD缺乏症的临床研究中。G6PD缺乏症主要分为新生儿黄疸、急性溶血症贫血、慢性非球形红细胞溶血行贫血三类，全世界约有4亿G6PD缺乏症患者，主要分布在东南亚、非洲和地中海沿岸等地，并且男性患者明显多于女性。我国广东、海南等地人群的患病率较高。我国人群中已发现G6PD基因突变位点超过20种。G6PD缺乏症患者红细胞表面G6PD缺乏而引发的一系列反应，从而导致红细胞破坏并溶血。根据G6PD酶的活性缺乏程度及临床表现分为五种亚型。

1.CRISPR-Cas9技术在G6PD缺乏症中具体应用

SPENCER等人利用CRISPR-Cas9技术培养G6PD基因敲除细胞系，研究发现G6PD基因敲除细胞系的G6PD表达下降，这证明了CRISPR-Cas9技术可用于编辑G6PD基因组。TANG等向单细胞人胚胎中注射恰当的sgRNA和同源供体复合的Cas9蛋白，证明G6PD基因中点突变可由有效的同源重组来介导校正。根据CRISPR-Cas9系统编辑原理，PAM区上游的3～8碱基处的目的基因可由sgRNA引导Cas9蛋白切割，即大部分G6PD缺乏症突变位点可通过CRISPR-Cas9技术修复，如我国常见的几种突变95A>G、1376G>T、1024C>T等。人工设计特异性sgRNA来引导的Cas9蛋白针对导致G6PD缺乏症突变点进行切割，提供DNA修复模板进行同源修复以便修复突变位点，也可将G6PD缺乏症患者体细胞重编辑为iPSCS，将G6PD缺乏症患者来源的iPSCS中的致病突变基因通过CRISPR-Cas9技术进行修复，最终将修复后的iPSCS誘导分化为红系祖胞移植到G6PD缺乏症患者体内，以治疗G6PD缺乏症。CRISPR-Cas9系统作为遗传性疾病的新型治疗技术具有无限大的潜力和广阔的应用前景。

（二）肿瘤研究

肿瘤吸烟、大气污染和烟尘中含有致癌物质等因素有关，威胁人类生命健康的原因有恶性程度高、高耐药性等。而近期研究发现跨膜转录因子NFE2L1在癌症中扮演着抑癌基因的重要角色。NFE2L1又称NRF1，属于碱性亮氨酸拉链之一。其在胚胎发育、肿瘤发生等研究中发挥着重要作用。有实验表明，利用CRISPR-Cas9技术将成年小鼠肝细胞内NFE2L1基因敲除后会引发自发性脂肪肝并持续恶化为肝癌死亡，可见，NFE2L1在抑癌中的关键作用。

1.CRISPR-Cas9技术在肿瘤疾病中应用

肺癌是一种细胞恶性增殖疾病，而NFE2L1对癌细胞增殖能力进行调节，且由实验结果分析，在敲除NFE2L1后进行肿瘤细胞增殖培养48小时后，肿瘤细胞增值明显。NFE2L1信号通路可诱导其下游调控的多种抗氧化酶表达，是细胞内重要的内源性抗氧化防御调节机制之一。NFE2L1与肝脏疾病的发生发展有着密不可分的关系。CRISPR-Cas9是细菌适应性防御系统，可特异性切割外源基因、准确地进行基因编辑。利用CRISPR-Cas9技术研究基因缺失与肿瘤表现型之间的关系，为肿瘤研究治疗树立了新的方向。根据Ren等研究结果显示NFE2L1在肝正常细胞表达明显高于在肝癌细胞中的表达，即可证明NFE2L1发挥着抑癌因子作用。EMT重新编辑被认为是胚胎形成所必需的基础，若使用CRISPR-Cas9技术敲除胚胎发育期小鼠的NFE2L1基因，则小鼠会死亡，可见EMT转化在胚胎发育、细胞癌变转移中发生。在过肿瘤细胞发展初期通过EMT转化，并获得其离开原发肿瘤的能力，进入周围组织并扩散到机体内，最终导致对集体损伤。CRISPR-Cas9技术可对DNA序列进行编辑，促进NFE2L1转录因子的表达，从而调节细胞增殖、凋亡及血管生成有关生化反应。

三、结语

随着基因编辑技术迅速发展CRISPR-Cas9技术在肺癌研究领域及多种遗传疾病研究领域发挥着重要作用，也对疾病的发生发展机制提供了巨大便利。CRISPR-Cas9技术作为一个重要基因编辑工具也被应用到众多实验研究中。近期，CRISPR-Cas9技术在肺癌相关研究中成功检查出NFE2L1有抑癌因子的作用，规范了以后研究工作。目前，也有研究学者构想出了通过CRISPR-Cas9技术编辑基因突变位点从而治疗G6PD缺乏症等遗传疾病，为遗传疾病治疗开拓了空间，并且奠定了理论基础。CRISPR-Cas9技术虽相对其他基因编辑技术有构建成本低、靶向修饰效率高、可进行多靶点同时编辑等优势，但CRISPR-Cas9仍存在安全性、脱靶效应和特异性等问题需要解决，这对胚胎或配子的可遗传基因组编辑所带来的风险仍无法估测。但是不可否认CRISPR-Cas9技术有着广泛的应用前景，生物医学科研机构和实验室可对CRISPR-Cas9技术进行完善和拓展，使CRISPR-Cas9技术应用到更多领域。

参考文献：

[1]一种新的由CRISPR/Cas系统介导的基因组靶向修饰技术[J].中国生物工程杂志，2013，（10）：117-123.

[2]王梦瑶，杨亦农，边红武.基于CRISPR-Cas系统的基因组定点修饰新技术[J].中国生物化学与分子生物学报，2014，（05）：426-433.

[3]陈万青，张思维，邹小农.中国肺癌发病死亡的估计和流行趋势研究[J].中国肺癌杂志，2010，（05）：488-493.

[4]徐芸，罗建明.我国G6PD缺乏症基因突变的研究现状[J].中国小儿血液与肿瘤杂志，2009，（03）：143-144.

（作者单位：沈阳市第一中学）

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