液基细胞学联合免疫细胞化学检测技术在胸水诊断中的应用

检查是判断胸水良恶性最简单易行的检测方法。常规胸水涂片中细胞少、分布不均匀、背景不清晰，增生的间皮细胞和腺癌细胞有时难以鉴别[1]。与传统的脱落细胞学涂片检查相比，液基细胞学检测在标本保存、制片、染色和诊断等方面都有显著优势，是提高标本检测准确率和检出率的一种新技术[2]。该研究随机收集该院2010年1月—2014年12月临床送检的肺腺癌和反应性增生间皮细胞胸水病例各30例，通过联合液基细胞学和免疫细胞化学检测技术，检测甲状腺转录因子-1（TTF-1）、细胞角蛋白-7（CK7）和间皮细胞蛋白 （MC）、钙结合蛋白（CR）在胸水细胞中的表达，探讨其在胸水细胞学诊断和鉴别诊断中的临床应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机收集该院2010年1月—2014年12月临床送检的肺腺癌和反应性增生间皮细胞胸水病例各30例，其中肺腺癌胸水病例男性13例，女性17例，平均年龄（53.7±14.441）岁，反应性增生间皮细胞胸水病例男性14例，女性16例，平均年龄（46.2.±10.829）岁。所选病例诊断依据临床资料、影像学检查及病理组织学结果。

1.2 仪器

低速离心机（SC3612 安徽中科中佳科学仪器有限公司）、调速多用振荡器（HY-2 常州市华普达教学仪器有限公司）、液基自动染色机（Tib AutoPrep1800泰普生物科学有限公司）、光学显微镜（Olympus BX41）。

1.3 试剂

液基细胞学试剂由泰普生物科学有限公司提供，免疫细胞化学抗体（TTF-1、CK7、CR、MC）、S-P超敏试剂盒（鼠/兔）、DAB显色试剂盒由福州迈新生物技术开发有限公司提供。

1.4 方法

1.4.1 液基细胞学制片 临床送检的新鲜胸水标本取50 mL，离心机2 000 r/min离心5 min，去上清，加入细胞保存液，静置5 min。取离心静置后的标本进行过滤处理，去除血液、蛋白液、细胞碎片等成分。加入梯度离心液进行梯度离心，去上清、震荡，使离心管底部沉积的细胞处于悬浮状态。将处理好的标本放入液基自动染色机中进行染色。

1.4.2 疫细胞化学染色 将剩余的胸水标本离心过滤制成细胞悬浮液（处理过程同上）。将处理好的标本移入染色槽中沉降 10 min。倒出剩余的标本，经过固定、冲洗、风干处理后用于免疫细胞化学染色。免疫细胞化学步骤按S-P超敏试剂盒及DAB显色试剂盒说明进行。

1.5 评价标准

由两名病理医师阅片镜检进行结果判定。阳性表达为着色定位准确并呈明显棕黄色或棕褐色颗粒。CK7阳性表达为细胞膜着色；TTF-1阳性表达为细胞核着色；MC阳性表达为肿瘤细胞浆或间皮细胞的胞膜着色；CR阳性表达为细胞核或细胞质着色。

1.6 统计方法

采用SPSS13.0软件进行数据处理，计数资料采用n（%）表示，采用χ2检验，以 P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 液基细胞学镜检

腺癌细胞形态学特征为：细胞紧密排列呈腺腔样、乳头状、团状，三维立体结构明显。细胞核大、深染，染色质粗，核仁明显，核膜厚，核浆比大。胞浆内可见粘液性空泡，核偏位呈印戒样。反应性增生的间皮细胞形态学特征为：细胞单个散在或成片排列，平铺状，无明显的三维立体结构，部分细胞核大、深染，可见1～2个核仁，但胞浆丰富，染色质细腻。

2.2 免疫细胞化学

CK7、TTF-1 、MC、CR在胸水腺癌细胞和反应性增生的间皮细胞表达阳性结果见表1。

3 讨论

液基细胞学技术是近年来出现的一种新的细胞学制片技术，在临床妇科和非妇科细胞学检查中都得到了广泛应用。与传统的胸水细胞涂片方法相比其优势主要体现在以下几个方面：（1）制片 自动化、标准化程度高，减少了手工操作的误差。细胞分布均匀，厚薄一致，不易掉片。去除了红细胞和蛋白等的干扰，使背景清楚，细胞学形态清晰可见，三维立体效果明显易于诊断[3]。（2）诊断 细胞集中沉降于直径15 mm的面积中，缩减了镜检范围，减少阅片时间，使误诊率和漏诊率大大降低，提高了诊断的准确性和可靠性[4]。（3）鉴别诊断 保存了细胞抗原的生物特性，对细胞免疫化学检测无影响，两者联合可用于胸水细胞学的鉴别诊断。

增生的间皮细胞和腺癌细胞受到胸水的刺激会发生形态学上的改变，因而单纯使用细胞形态学鉴别两者有时会存在一些诊断困难[5]。免疫细胞化学染色是胸水细胞学诊断的重要手段，液基细胞学与免疫细胞化学检测技术联合使用有助于提高胸水的诊断率。CK7是分子量为54 Kda的细胞角蛋白，常表达于卵巢、肺、乳腺的上皮细胞质中，可作为肺腺癌分化的客观指标[6-7]。侯兴华等[8]研究报道CK7在胸水诊断中的灵敏性为85.7%，特异性为96%。TTF-1是分子量为38～40 Kda的核蛋白，在甲状腺上皮、胎儿肺组织和成人Ⅱ型肺泡上皮中存在，除外甲状腺来源的肿瘤后可作为肺腺癌较为特异的肿瘤标记物[9-10]。Ng WK等[11]研究报道TTF-1在胸水诊断中的灵敏性为88.2%，特异性为100%， Ye J等[12]研究显示TTF-1在胸水中表达的灵敏性为80%，特异性为100%。该研究中CK7和TTF-1在胸水腺癌细胞诊断中的灵敏性分别为93.3、83.3%%，特异性分别为90%、100%，与研究结果较为相符。MC是一种酸性氨基多聚糖蛋白，阳性表达部位为肿瘤细胞浆或间皮细胞的胞膜着色，在鉴别腺癌及间皮细胞中具有较好的灵敏性和特异性[13-14]。崔彬等[15]研究结果显示MC在间皮细胞中表达的灵敏性为91.3%，特异性为95.2%。CR是一种相对分子质量为29 Kda的钙结合蛋白，是鉴别胸水非肿瘤性间皮细胞和肿瘤细胞较好的标记物[16]。研究显示[17-19]，CR在间皮细胞中表达的灵敏性为81.6%～100%，特异性87.2%～97.1%。该研究中MC和CR在胸水增生的间皮细胞诊断中的灵敏性分别为83.3%、86.7%，特异性分别为93.3%、90%，与文献研究结果较为一致。单个抗体对不同肿瘤的特异性和敏感性不同，该文联合使用TTF-1、CK7、MC、CR四种免疫组化染色指标联合检测的方法，对增生的间皮细胞和腺癌细胞进行诊断和鉴别诊断，相互补充，能有效地提高诊断的灵敏度和特异度。

胸腔积液良恶性的诊断和鉴别诊断对于疾病的诊断、治疗和预后具有重要意义。该文联合液基细胞学和免疫细胞化学两种方法对胸水进行检测，显著提高了胸水细胞学检查的制片质量和诊断能力，细胞形态学和免疫学结合为胸水腺癌和增生的间皮细胞诊断和鉴别诊断奠定了良好的基础。

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（收稿日期：2015-12-08）

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