肿瘤厌氧靶向双自杀基因治疗系统ｐＨ２／ＣＤ，ｐＨ２／ＵＰＲＴ的构建

【摘要】 目的 利用婴儿双歧杆菌对实体瘤低氧区的靶向效应，构建肿瘤厌氧靶向双自杀基因治疗系统pH2/CD和pH2/UPRT。方法 用PCR的方法从质粒pGEX/CD和pGEX/UPRT中扩增出CD基因和UPRT基因，用内切酶BamH I和Sal I酶切CD基因，UPRT基因和质粒pH2，分别连接后重组于大肠杆菌中。用电转化的方法将重组质粒转入婴儿双歧杆菌中。通过双酶切和基因测序的方法检验质粒pH2/CD和pH2/UPRT的正确性，RT-PCR检测该系统的mRNA表达。在黑色素瘤B16-F10细胞上检测该系统的体外肿瘤细胞杀伤效果。结果 成功地将CD基因和UPRT基因转入了乳酸菌表达质粒pH2，在纯化后的质粒被双酶切后，CD基因被分割为6．9 kb和1．3 kb的两部分，UPRT基因被分割为6．9 kb和620 bp的两部分。CD基因和UPRT基因的测序结果表明序列与Genebank公布的序列一致。RT-PCR检测到CD和UPRT mRNA的明显表达。黑色素瘤细胞的低存活率证明pH2/CD,pH2/UPRT自杀基因治疗系统对黑色素瘤的强大杀伤作用。 结论 肿瘤厌氧靶向双自杀基因治疗系统pH2/CD,pH2/UPRT构建成功并显示出强大的杀伤肿瘤细胞的作用。

【关键词】 双歧杆菌； 自杀基因；CD基因； UPRT基因；肿瘤靶向性

Construction of tumor-targeting anaerobic double suicide gene therapy system pH2/CD and pH2/UPRT in Bifidobacterium Infantis

YE Peng,LI Zhu-hua,YANG Yan-bin,et al.Department of Pathophysiology,West China School of Pre-clinic Medical Sciences and Forensic Medicine,Sichuan University,sichuan610041,China

【Abstract】 Objective To construct pH2/CD and pH2/UPRT double suicide gene therapy system in tumor-hypoxia-targeting vector Bifidobacterium Infantis.Methods CD gene and UPRT gene were amplified from pGEX/CD and pGEX/UPRT using PCR,and then the CD gene,UPRT gene and lactic acid bacteria expression plasmid pH2 were digested by restriction endonulease BamH I and Sal I,and constructed recombinant plasmids pH2/CD and pH2/UPRT in E.coli.The recombinant plasmids were then transfected into Bifidobacterium Infantis by electroporation.Identification of pH2/CD and pH2/UPRT was processed by double restriction endonulease digesting and sequencing.RT-PCR was used to examine the expression of CD and UPRT genes at RNA level.The killing effects for tumor cells by pH2/CD and pH2/UPRT suicide gene therapy system with 5-FC were done on Melanoma B16-F10 cells.Results The CD gene and UPRT gene were successfully recombined into lactic acid bacteria expression plasmid pH2．After double endonuclease digestion of plasmid purified from the positively transfected E coli,two fragments of 6．9 kb and 1．3 kb were found for CD gene and two fragments of 6．9 kb and 620 bp were found for UPRT gene.The sequencing of CD gene and UPRT gene proved consistent sequences with Genebank published data.A fragment of 1．3 kb for CD gene and fragment of 620 bp for UPRT gene was found in recombinant Bifidobacterium by RT-PCR.The survival rate of tumor cells treated by extracts from culture of recombinant Bifidobacterium with 5-FC showed a strong killing effects of pH2/CD and pH2/UPRT double suicide gene therapy system on Melanoma B16-F10 cells.Conclusion CD gene and UPRT gene were successfully inserted into pH2 and transfected into tumor-hypoxia-targeting vector Bifidobacterium Infantis.This double suicide gene therapy system showed a high efficiency for tumor cells killing.

【Key words】

Bifidobacterium ;Suicide gene;CD gene;UPRT gene;Tumor-targeting

如今仍然有两个因素制约着对于肿瘤的基因治疗措施：①外源基因在肿瘤组织中的表达效率偏低；②载体的肿瘤靶向性不高。肿瘤自杀基因治疗系统或者酶-药物前体治疗系统同样摆脱不了这种缺点。但是，通过使用以肿瘤低氧区为靶点的靶向载体， 我们可能会找到一个较理想的解决这些缺点的方法。

本实验室^[1]以及其他一些报道已经证明，某些非致病性的厌氧菌可倾向性的在这些肿瘤低氧区内生存、增殖 ^[2]，从而使其具有了厌氧靶向的特征。通过这些具有靶向性的细菌携带大量表达外源基因的载体以及自杀基因，能够赋予自杀基因系统足够的肿瘤靶向特性。同时这些厌氧菌并不致病，保证了系统的安全性。在本实验中，我们成功地构建了pH2/CD(Cytosine Deaminase,胞嘧啶脱氨酶)，pH2/UPRT(Uracil Phosphoribosyltransferase，尿嘧啶磷酸核糖转移酶)肿瘤厌氧靶向双自杀基因治疗系统并且检测了其体外的抗肿瘤效果。

1 材料与方法

1．1 材料 质粒pH2由复旦大学生命科学院黄教授赠予，婴儿双歧杆菌2001株由四川大学华西口腔医学院赠予，引物合成和基因测序由Invitrogen Co.(上海)完成，质粒纯化试剂盒和PCR产物纯化试剂盒购自Omega Co.，PCR反应试剂盒和DNA Marker购自Promega Co.(USA)，BamH I,Sal I购自Takara Co.,200 bp DNA ladder marker 购自Qiagen Co.(北京),BHI(brain-heart infusion)培养基购自Oxoid Co.其他试剂均为国产分析纯。

1．2 方法 扩增CD基因和UPRT基因 分别接种携带有质粒pGEX/CD和pGEX/UPRT的大肠杆菌（E.coli）到5 ml LB液体培养基中37℃震摇过夜，纯化质粒pGEX/CD和pGEX/UPRT作为PCR反应的模板。根据CD基因在Genebank(NC-0009131)中的序列设计引物，上游引物为：5’-CCGGGATCCCTAACAATGTCGAATAAC-3’，下游引物为：5’-GTGGTCGACGAATTCTGTAACCCAGTC-3’。根据UPRT基因在Genebank(X57104)中的序列设计上游引物为5’-GGGATCCATGAAGATCGTGGAAGTC-3’，下游引物为：5’-GTGGTCGACGAATTCTGTAACCCAGTC-3’。PCR反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸1 min，重复30次。扩增后的基因用PCR产物纯化试剂盒“E.Z.N.A cycle-pure Kit”纯化后0．8%琼脂糖凝胶电泳验证基因大小的正确性。

限制性内切酶消化CD基因，UPRT基因和pH2质粒分别加入10 μl的CD基因，10 μl的UPRT基因和10 μl的pH2质粒到双酶切体系中(1 μl Bam HI,1 μl Sal I和3 μl 10×T buffer)，37℃水浴过夜。当酶切完成后，用PCR产物纯化试剂盒“E.Z.N.A cycle-pure Kit” 纯化，之后用0．8%琼脂糖凝胶电泳验证。

重组质粒的构建 CD基因和质粒的连接以及UPRT基因和质粒的连接是通过以下方法完成的：加入7 μl的CD基因片断，3 μl的质粒片断和1 μl的T4 DNA连接酶到一个EP管中，混匀；加入7 μl的UPRT基因片断，3 μl的质粒片断和1 μl的T4 DNA连接酶到另一个EP管中，混匀。然后，16℃孵育4 h，储存于-20℃。

重组质粒转化大肠杆菌（E.coli）以及婴儿双歧杆菌的电转化 转化过程参照《分子克隆实验指南》相关章节所述步骤。将转化后的菌液加到含有150 μg/ml红霉素的BHI固体平板培养基上，37℃孵育16 h，如Daniel J.O’sullivan and Todd R.Klaenhammer文献中所推荐^[3]。挑出阳性菌，加入5 ml 含有150 μg/ml 红霉素的LB培养基中，振摇过夜。之后纯化质粒并用电泳，双酶切和基因测序的方法验证其正确性。电转化是根据Alessandra Argnani描述的步骤进行^[4]。加入阳性菌液到含有10μg/ml 红霉素的20 ml MRS液体培养基中，37℃低氧环境下孵育48 h。之后提纯质粒并通过电泳和测序的方法检验。重组质粒在婴儿双歧杆菌中的表达以RT-PCR检测。

pH2/CD,pH2/UPRT自杀基因系统体外杀伤肿瘤细胞功能的检测对照组不含质粒的双歧杆菌，分别含CD基因，含UPRT基因的双歧杆菌，以及含CD基因，含UPRT基因双歧杆菌的混合液分别被接种于四组MRS培养基中，每组8瓶，37℃培养过夜。之后每组均加入浓度为0~100 mmol/L的5-FC，于37℃继续培养24 h。之后，每瓶取10 ml菌液，10 000 rpm离心5 h。收集上清液，加入2 ml醋酸乙酯，漩涡混匀，10 000 rpm，4℃离心10 h。将有机相移到2 ml EP管中，真空干燥。然后加入1 ml生理盐水溶解残渣，滤器过滤除菌，制成处理液。鼠黑色素瘤B16-F10细胞培养于DMEM培养基中，以180 μl/孔加入96孔板中。当细胞铺满60%~70%的孔底面积时，加入20 μl处理液，37℃继续培养48 h。使用MTT的方法检测活细胞的比率并计算存活率。

2 结果

2．1 大肠杆菌中pH2/CD和pH2/UPRT重组质粒的构建以及婴儿双歧杆菌的电转化 CD基因扩增产物大约为1．3 kb，与Genebank(Genebank,NC-0009131)中记录的CD基因大小相同。UPRT基因扩增产物大约为0．6 kb，与Genebank(Genebank,X57104)中记录的CD基因大小相同。酶切后的pH2质粒片断大约为6．9 kb。重组的pH2/CD约为8．2 kb，重组的pH2/UPRT质粒为7．5 kb。重组质粒pH2/CD和pH2/UPRT用双酶切系统酶切后的小片断与同一个基因的PCR扩增产物大小相同。(图1和图2)

质粒pH2/CD和pH2/UPRT的测序结果表明CD基因的大小和序列与Genebank(NC-0009131)中公布的序列相同，UPRT基因的大小和序列与Genebank(X57104)中公布的序列相同。测序结果证明CD基因和UPRT基因被正确的插入pH2质粒中。之后，重组质粒被成功的转化入双歧杆菌中。图3和图4为重组质粒mRNA在婴儿双歧杆菌中的表达结果。

2．2 pH2/CD,pH2/UPRT自杀基因系统体外杀伤肿瘤细胞功能的检测 MTT实验结果表明，含pH2/UPRT的婴儿双歧杆菌对鼠黑色素瘤细胞无杀伤效应，而含pH2/CD的婴儿双歧杆菌表现出较好的杀伤鼠黑色素瘤细胞的效应。随着剂量的提升，黑色素瘤B16-F10细胞的存活率呈下降趋势。双自杀基因的结合表现出显著的杀伤效应，当5-FC浓度达到1 μmol/ml时，黑色素瘤B16-F10细胞的存活率几乎接近0(图5和图6)。

3 讨论

肿瘤的自杀基因治疗已经发展了近20年，最初携带自杀基因的载体是病毒，而转染的对象为肿瘤细胞^[5-6]。但是，当施行系统治疗时，低的肿瘤靶向性、转化肿瘤细胞的低效率都限制了它的发展。因此，研究者们试图寻找有更高靶向性和更高杀伤肿瘤细胞自杀基因治疗系统。

以往很多研究结果已经证明，在实体瘤中存在一些低氧区域，尤其在瘤体的中央区，而这些低氧的区域非常适合厌氧菌的存活^[7-8]。恶性肿瘤中存在大量的无氧糖酵解，以及一个相对缺氧的区域，尤其是它的中心区域。Vaupel等研究了组织中的氧分压，发现在恶性实体瘤的中央区域氧分压低至2．5 mm Hg以下，远低于正常组织的24~66 mm Hg^[9]。实体瘤的这个特点可能会给厌氧菌在其低氧区定植提供良好的环境^[1-2]。这给了我们新的启示，厌氧菌可能成为一个抗肿瘤治疗的良好靶向载体。

胞嘧啶脱氨酶(CD)和5-氟-胞嘧啶(5-FC)系统(CD/5-FC)是自杀基因的原型，低毒的5-FC可以被CD代谢为抗肿瘤药5-FU。全身给药的5-FC到达肿瘤，而靶向到肿瘤局部的CD基因转化5-FC至5-FU将会杀死肿瘤细胞，但对全身的毒性则大大降低。因为很多肿瘤对5-FU产生抗性，所以构建(CD/5-FC)的协同杀伤机制将可能克服其抗药性，并明显增强CD/5-FC 肿瘤自杀基因治疗系统的效力。

5-FU杀灭肿瘤细胞的机制包括被进一步代谢为5-FdUMP,5-FdUTP和5-FUTP，这些分子可以干扰细胞RNA 和DNA 合成^[10-11]。UPRT 是一种来源于原核生物的酶，它可以非常有效的催化5-FU生成5-FdUMP，使得5-FdUMP，5-FdUTP,和5-FUTP大量增加，从而增强5-FC/CD系统对肿瘤细胞的杀伤作用。所以构建CD 和UPRT相结合的双自杀基因系统将可能显著增强该系统的肿瘤杀伤能力^[12-16]。

当厌氧菌被重组为携带有高效表达自杀基因的质粒时，厌氧菌的肿瘤靶向性将使得它们在肿瘤组织聚集，而原药5-FC将在肿瘤组织内部高效地被自杀基因CD/UPRT转化为细胞毒性的抗肿瘤药物。婴儿双歧杆菌是一种非致病性的厌氧菌株。本实验室在先前的研究中已经证明其对实体瘤的靶向性^[1]，并构建出携带有pGEX-1LamdaT/CD和pGEX-1LamdaT/UPRT的婴儿双歧杆菌，并且表现出体外对肿瘤的杀伤作用，但由于pGEX-1LamdaT是大肠杆菌表达载体，重组至厌氧菌中其蛋白质的表达效率并不令人满意^[16-17]。

质粒pH2是一个厌氧菌特异性质粒，带有一个分泌性基因表达系统，可以在乳酸菌和双歧杆菌中高效率表达分泌型蛋白质^[3]。我们最终成功的构建了pH2/CD和pH2/UPRT婴儿双歧杆菌分泌性自杀基因表达系统，并已获得CD，UPRT基因mRNA水平的良好表达。在体外杀伤鼠黑色素瘤细胞的实验中，当5-FC浓度达到1 μmol/ml时，双自杀基因表达系统组中黑色素瘤B16-F10细胞的存活率几乎接近0，该自杀基因表达系统表现出非常好的抗肿瘤效果，而该系统在鼠体内的抑瘤效果，以何种剂量，何种方式给药能达到最好的抑瘤效果，以及此系统的临床实用价值是我们将来所要解决的问题，有待我们进一步的实验验证。

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