黄芪六一汤对2型糖尿病治疗效果的转录组学研究

[摘要]该实验采用Illumina测序平台对大鼠胰腺进行转录组测序，对靶点进行表达量统计，分析空白组、模型组、黄芪六一汤组三者之间的表达差异关系，探究黄芪六一汤对2型糖尿病的治疗效果，并探讨其作用机制。结果表明，通过eggNOG对基因进行分类分析，其中有2425%的基因属未知功能类，为最大分类单元，其余依次为能量转换类、氨基酸转运和代谢类、核苷酸转运和代谢类、碳水化合物转运和代谢类、辅酶转运和代谢类、脂质转运和代谢类等；根据KEGG富集分析，黄芪六一汤可能在环境信息处理、细胞过程、生物系统、人类疾病这4类代谢通路上对2型糖尿病起到治疗作用。研究表明，黄芪六一汤能显著改善2型糖尿病大鼠空腹血糖、糖化血红蛋白。

[关键词]黄芪六一汤； 2型糖尿病； 转录组学； eggNOG分析； KEGG富集分析

[Abstract]In this study， Illumina sequencing platform was applied in sequencing rat pancreas， counting expression of target points， analyzing expression differences among blank group， model group and Huangqi Liuyi decoction group and exploring the therapeutic effect and mechanism of Huangqi Liuyi decoction on type 2 diabetes mellitus According to the result， 2425% of these genes belonged to the unknown functional class， which was the largest classification unit according to the classification analysis of genes by eggNOG The rest were classified as energy conversion， amino acid transport and metabolism， nucleotide transport and metabolism， carbohydrate transport and metabolism， coenzyme transport and metabolism， and lipid transport and metabolism， etcHuangqi Liuyi decoction may play a therapeutic role in the treatment of type 2 diabetes mellitus through four metabolic pathways， namely environmental information processing， cellular process， organismal system and human diseases according to KEGG eichment analysis This study shows that， Huangqi Liuyi decoction can significantly improve the fasting blood glucose and glycosylated hemoglobin in type 2 diabetic rats

[Key words]Huangqi Liuyi decoction； type 2 diabetes mellitus； transcriptomics； eggNOG analysis； KEGG eichment analysis

糖尿病是一種以失控的高血糖为主要表现，多种并发症为主要损害的一种代谢性疾病，病程长且复杂，难以根治，已严重影响人们的健康生活[1]。中药及中药复方对糖尿病起到了治疗作用，常用中药有人参、黄芪、地黄、甘草等[2]。其中，黄芪多糖可抑制由内质网压力引起的活化转录因子的活性，增加2型糖尿病大鼠肝脏组织中的AMPK磷酸化水平，降低蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B） 的过表达，以提高大鼠胰岛素敏感性，增加KKAy大鼠对高血糖症和口服葡萄糖的耐受性[36]。Honda K等[7]将减少血浆胰岛素浓度作为改善胰岛素抵抗的指标，并通过实验证明甘草总黄酮明显降低血浆胰岛素浓度，因此推测甘草总黄酮能改善胰岛素抵抗。黄芪六一汤由黄芪、炙甘草组成，具有补气、生津等功效。转录组（transcriptome）是指特定细胞在某一功能状态下全部表达的基因总和，代表了每一个基因的身份和表达水平，转录组测序能全面的地揭示生物个体在特定组织和特定时期的全局基因的表达情况[8]。本实验通过黄芪六一汤对2型糖尿病治疗效果转录组学的研究，表明黄芪六一汤可能通过改善新陈代谢通路从而对2型糖尿病起到治疗作用。

1材料

11动物选用SPF级雄性大鼠40只，体质量（200±20） g，鼠龄6～8周（黑龙江中医药大学药物安全评价中心），许可证号SCXK（黑）2013004。动物饲养于SPF级动物实验室，实验室温度（22～24 ℃），湿度（45%～55%），日光照12 h，动物分笼饲养（10只/笼），自由觅食饮水。实验过程中对动物处置符合动物实验伦理标准。

122型糖尿病大鼠模型构建目前得到2型糖尿病大鼠的方法有2种，第1种是直接购买基因敲除的大鼠，第2种就是国内广大研究人员普遍采用的造模方法[9]，即采用链脲佐菌素（STZ）腹腔注射获得2型糖尿病大鼠。综合实验技术熟练程度、资金等方面因素，采用STZ腹腔注射的方法复制2型糖尿病大鼠模型。

取大鼠40只，适应饲养7 d后，随机选取10只作为空白对照组，空白对照组给予普通饲料，其余30只大鼠给予高糖高脂饲料3周。3周后，大鼠禁食12 h后腹腔注射柠檬酸柠檬酸钠缓冲液（pH 45）溶解的STZ（40 mg·kg-1），配置STZ后冰浴并快速注射，以免药物降解药效失效。空白对照组腹腔注射等剂量的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液。末次给药72 h后禁食12 h检测血糖，将血糖≥167 mmol·L-1确定为糖尿病大鼠，共得到造模成功大鼠26只。

13分组及干预方法选取造模成功大鼠中的20只并随机分成2组。分为模型对照组、黄芪六一汤组。空白对照组、模型对照组：造模后第7天开始给予生理盐水10 mL·kg-1·d-1；黄芪六一汤组：造模后第7天按照鼠人折算剂量分别以不同药物灌胃，灌服中药黄芪六一汤（生药1260 g·kg-1），1次/d；给药量=人体给药量×0018×20。大鼠每周称重1次，按照体重调整灌胃剂量，连续灌胃4周。

本实验选择实验4周后空白组、模型组、黄芪六一汤组大鼠胰腺作为转录组测序实验材料。大鼠末次给药后禁食12 h，用20%乌拉坦溶液对大鼠腹腔注射麻醉。麻醉后，快速取胰腺组织，铝箔包裹并迅速冻存于液氮中，然后冻存于-80 ℃冰箱。

14黄芪六一汤的制备工艺取黄芪饮片600 g和甘草饮片100 g，加水2 L，浸泡2 h，煎煮1 h，滤过，回收滤液；药渣加水2 L，煎煮05 h，滤过，弃去滤渣，合并滤液，减压浓缩至700 mL。药液置于棕色瓶中，密封储存于4 ℃冰箱备用。

2方法

21大鼠胰腺总RNA的提取与质检采用天恩泽柱式动物RNAout试剂盒（CAT#：71201）对样品进行RNA提取。采用15%琼脂糖凝胶电泳对获得的总RNA完整性检测，表明RNA条带完整，无降解。利用紫外分光光度计对RNA进行定量检测，达到要求浓度，且A260/A280大于18。

22转录组文库构建第一步：mRNA的纯化，采用Illumina的TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit。针对真核生物mRNA特有的poly A结构，利用oligo dT磁珠捕获mRNA。

第二步：反转录及cDNA文库构建，采用Illumina的TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit。

第三步：cDNA文库构建，首先是3′端加A，在这一过程中，DNA的3′端会单独加上一个A碱基，以防止DNA片段的自連，同时保证DNA与3′端有一个突出T碱基的测序接头相连，而后加一个有特异性标签的接头，此过程是为了让DNA最终杂交到Flow Cell上。

23cDNA文库质检与测序首先取1 μL cDNA文库，采用Agilent Bioanalyzer 2100对构建的文库进行质检。利用QuantiT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor上对文库进行定量分析。对合格cDNA文库，进行转录组测序。测序由上海派森诺生物科技有限公司完成，采用Illumina NextSeq 500 High Output Kit（300cycles）测序平台进行2×150 bp的双端测序。测序样品为大鼠胰腺RNASeq文库。

24原始数据过滤及质控分析符合要求的测序数据序列经过进一步除去低质量序列和接头序列，减少对后续分析的影响。数据过滤标准为：①去除Reads 接头序列；②从Reads 3′端向5′端去掉平均质量小于Q20的部分（5 bp窗口）；③去除最终长度小于50 bp的序列；④序列中没有不确定碱基。原始数据通过质量过滤后，通过FastQ（http：//www. bioinformatics. babraham. ac. uk/projects/fastqc/）进行质量过滤质控分析。

3结果与分析

31大鼠胰腺转录组原始数据统计样品通过上机测序，得到的最原始的测序数据以FASTQ格式的形式储存。下机原始数据每个样本的Reads数以及数据总量见表1。

32大鼠胰腺转录组原始数据过滤统计对大鼠胰腺转录组数据分别统计，统计结果见表2。通过对转录组数据质量过滤质控结果分析可知，本次测序过滤后的数据平均质量很高，基本分布在Q>28区域。绝大部分Reads质量都分布在35左右，说明整体Reads平均质量都很高。一般而言5′端碱基的ATGC百分比会有所波动，中间和3′端碱基比较稳定，A与T大致相等，C与G大致相等。曲线形状的偏差较小，本次实验理论值与实测值符合较好。

33比对到基因组（Mapping）参照基因组：Rattus_norvegicusRnor_60dnatoplevelfa （ftp：//ftpensemblorg/pub/release80/fasta/rattus_norvegicus/dna/）。分析软件：bowtie2/tophat2 （http：//tophatcbcbumdedu/）。样本比对到基因组上的数据见表3。

34eggNOG分析eggNOG（evolutionary genealogy of genes： nonsupervised orthologous decoctions） 是一个包含943种细菌，69种古生菌和121个真核生物的直系同源蛋白质聚类数据库[1011]。根据先前的研究，蛋白质可分为25个功能类别。eggNOG数据库包括蛋白质直系同源簇（COGs）数据库和KOG数据库。将得到的Unigene进行KOG注释后，归入适当的KOG簇，由此对基因组的所有基因功能做分类统计，从宏观上认识该物种的基因功能分布特征。

经对大鼠转录组数据处理，共有3 777条unigene（9999%），eggNOG共分26类。其中“未知功能”（916条，占比2425%）；仅一般功能预测（619条，占比1639%）在eggNOG中是2个最大的分类单元。“翻译后修饰，蛋白转换，分子伴侣”（334条，占比884%）；“信号转导机制”（301条，占比797%）；“翻译，核糖体结构和生物转化”（210条，占比556%）。“细胞运动”（5条，占比013%），“真核细胞外结构”（3条，占比008%），“核结构”（1条，占比003%）有最少的直系同源基因，见图1。

35KEGG富集分析京都基因与基因组百科全书库数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）是系统分析基因功能和基因组信息的数据库，它整合了基因组学、生物化学以及功能组学的信息[12]。KEGG数据库有助于研究者把基因及表达信息作为一个整体的网络进行研究。KEGG通路分类富集分析图见图2。

在模型组与空白组比较中，在代谢途径分类中：参与脂类代谢的500个基因中含有43个差异表达基因（P=508×10-16）；参与Overview的227个基因中含有29个差异表达基因（P=141×10-15）；参与氨基酸代谢的352个基因中含有29个差异表达基因（P=982×10-11）；参与碳水化合物代谢的417个基因中含有30个差异表达基因（P=122×10-9）；参与其他氨基酸代谢的98个基因中含有9个差异表达基因（P=0000 137）；参与多糖生物合成与代谢的276个基因中含有14个差异表达基因（P=0001 227）；参与异源物质的降解和代谢的156个基因中含有9个差异表达基因（P=0003 845）；参与辅助因子和维生素代谢的174个基因中含有9个差异表达基因（P=0007 753）；参与能量代谢的191个基因中含有10个差异表达基因（P=0004 726）。在遗传信息处理分类中：参与折叠、分类和降解的408个基因中含有14个差异表达基因（P=0032 386）。在环境信息处理分类中：参与信号分子与互作的659个基因中含有20个差异表达基因（P=0038 102）。在细胞过程分类中：参与转运和代谢的507个基因中含有22个差异表达基因（P=0000 503）。在生物系统分类中：参与内分泌系统的956个基因中含有44个差异表达基因（P=173×10-7）；参与消化系统的441个基因中含有32个差异表达基因（P=271×10-10）；参与环境适应的107个基因中含有7个差异表达基因（P=0005 281）。在人类疾病分类中：参与免疫系统疾病的390个基因中含有28个差异表达基因（P=461×10-9）；参与心血管疾病的237个基因中含有9个差异表达基因（P=0045 857）；参与内分泌代谢途径的236个基因中含有18个差异表达基因（P=141×10-6）；参与传染性疾病的1 983个基因中含有56个差异表达基因（P=0003 92）。

黄芪六一汤组与空白组比较，在新陈代谢分类中：参与脂类代谢的500个基因中含有22个差异表达基因（P=0000 944 667）。在环境信息处理分类中：参与信号转导的2 114个基因中含有129个差异表达基因（P=714×10-30）；参与信号分子交互的659个基因中含有58个差异表达基因（P=172×10-20）。在细胞过程分类中：参与运输和分解代谢的507个基因中含有27个差异表达基因（P=104×10-5）；参与细胞运动的167个基因中含有13个差异表达基因（P=532×10-5）；参与细胞间通信的384个基因中含有19个差异表达基因（P=0000 522 065）。在生物系统分类中：参与免疫系统的1 147个基因中含有125个差异表达基因（P=292×10-55）；参与内分泌系统的956个基因中含有63个差异表达基因（P=639×10-16）；参与消化系统的441个基因中含有34个差异表达基因（P=758×10-11）；参与发育的222个基因中含有17个差异表达基因（P=488×10-6）；参与环境适应的107个基因中含有9个差异表达基因（P=0000 420 574）；参与排泄系统的149个基因中含有9个差异表达基因（P=0004 249 559）；参与循环系统的277个基因中含有13个差异表达基因（P=0005 901 147）。在人类疾病分类中：参与感染性疾病的1 983个基因中含有193个差异表达基因（P=242×10-81）；参与免疫疾病的390个基因中含有57个差异表达基因（P=219×10-31）；参与内分泌代谢疾病的236个基因中含有24个差异表达基因（P=203×10-10）；参与癌症的1 557个基因中含有69个差异表达基因（P=262×10-9）；参与心血管疾病的237个基因中含有23个差异表达基因（P=122×10-9）。

黄芪六一汤组与模型组比较，在新陈代谢分类中：参与Overview的227个基因中含有45个差异表达基因（P=6219 17×10-28），参与脂类代谢的500个基因中含有50个差异表达基因（P=260×10-17），参与糖代谢的417个基因中含有44个差异表达基因（P=323×10-16），参与氨基酸代谢的352个基因中含有35个差异表达基因（P=216×10-12），参与外来物质的降解和代谢的156个基因中含有19个差异表达基因（P=931×10-9），参与其他氨基酸代谢的98个基因中含有14个差异表达基因（P=112×10-7），参与能量代谢的191个基因中含有15个差异表达基因（P=744×10-5），参与其他次生代谢产物的生物合成的40个基因中含有5個差异表达基因（P=0002 761 753）。在环境信息处理分类中：参与信号转导的2 114个基因中含有109个差异表达基因（P=304×10-14），参与信号分子相互作用的659个基因中含有43个差异表达基因（P=565×10-9）。在细胞过程分类中：参与转运和分解代谢的507个基因中含有35个差异表达基因（P=392×10-8），参与细胞通讯的384个基因中含有18个差异表达基因（P=0006 641 926），参与细胞移动性的167个基因中含有10个差异表达基因（P=0008 067 433）。在生物系统分类中：参与免疫系统的1147个基因中含有97个差异表达基因（P=200×10-27），参与内分泌系统的956个基因中含有68个差异表达基因（P=216×10-15），参与消化系统441个基因中含有33个差异表达基因（P=142×10-8），参与环境适应性的107个基因中含有13个差异表达基因（P=211×10-6），参与发育的222个基因中含有14个差异表达基因（P=0001 170 584）。在人类疾病分类中：参与传染性疾病的1 983个基因中含有182个差异表达基因（P=125×10-59），参与免疫系统疾病的390个基因中含有35个差异表达基因（P=394×10-11），参与内分泌代谢系统疾病的236个基因中含有23个差异表达基因（P=198×10-8），参与癌症的1 557个基因中含有73个差异表达基因（P=561×10-8），参与心血管疾病的237个基因中含有20个差异表达基因（P=165×10-6）。

4结论与讨论

通过对本实验数据进行差异基因eggNOG分析后发现，“未知功能”分类所占比例最高，达到检测基因总数的2425%，推断可能是诱发糖尿病致病的未知基因。值得注意的是，“表皮生长因子受体”、“氨基酸转运和代谢”、“核苷酸转运和代谢”、“碳水化合物转运和代谢”、“辅酶转运和代谢”、“脂质转运和代谢”也同样有可能直接或间接影响2型糖尿病发生与发展。在糖代谢过程中，除了葡萄糖，果糖和甘露糖在糖尿病患者和空腹血糖异常人中含量也较高。当肝果糖代谢受到损伤，会中断果糖的转运，作用于多元醇通路可能导致血清果糖的增量。血清果糖的升高可能是诱发胰岛素抵抗的原因之一，可能反过来影响葡萄糖代谢。在氨基酸代谢过程中：国外研究人员通过嵌入式病例对照研究发现3种支链氨基酸、2种芳香族氨基酸、酪氨酸和苯丙氨酸可作为健康人發展成糖尿病患者预测的重要指标[13]。研究人员通过横断面调查还发现α羟基丁酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺支链氨基酸在糖尿病患者中显著升高[14]。在脂肪酸代谢过程中：目前，脂肪酸已为独立预测糖尿病发展的因素，通过大量的脂肪溶解和游离脂肪酸增多（Randle cycle假说）、细胞内脂质衍生物的积累（如甘油二酯）、氧化应激反应、炎症和线粒体功能障碍，进而影响胰岛素作用机制[15]。

根据KEGG富集分析，模型组与空白组比较的显著差异表达基因主要集中在新陈代谢、生物系统、人类疾病分类上；黄芪六一汤组与空白组比较的显著差异表达基因主要集中在环境信息处理、细胞过程、生物系统、人类疾病分类上；黄芪六一汤组与模型组比较的显著差异表达基因主要集中在新陈代谢、环境信息处理、细胞过程、生物系统、人类疾病分类上。对各组间KEGG富集分析图分析，图2中B与C显著差异表达基因在环境信息处理、细胞过程、生物系统、人类疾病分类上的总体趋势较为接近。但与A图中这3类的总体趋势差异较大。据此推测，黄芪六一汤可能在环境信息处理、细胞过程、生物系统、人类疾病这4类代谢通路上对2型糖尿病起到治疗作用。在新陈代谢分类上，黄芪六一汤组的总体趋势介于空白组与模型组之间，表明黄芪六一汤可能通过改善新陈代谢通路从而对2型糖尿病起到治疗作用。

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[责任编辑张宁宁]

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