MMPs和TIMPs与糖尿病心肌病心室重构的关系及糖心宁的干预作用

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1.1 材料

1.1.1 动物

雄性SD大鼠（由中国食品药品检定研究院提供，SCXK（京）2014-0013）36只，SPF级，体重180～220 g，于SPF级动物房喂养，饲养条件为恒温20～24 ℃，相对湿度40～70，明暗交替12 h/12 h，普通饲料，自由进食水。

1.1.2 药物

糖心宁组成（太子参、麦冬、五味子、丹参、川芎、香附、香橼、佛手、牡丹皮、赤芍、黄连），由北京中医医院中药房提供。糖心宁制备成水煎剂，等效剂量为成人正常剂量按体表面积系数折算乘以7，高剂量为等效剂量的2倍。

1.1.3 試剂与仪器

链脲佐菌素（STZ货号：S0130，Sigma）、糖原染色试剂盒（PAS货号：MST-8037，迈新生物技术开发有限公司）、Masson染色试剂盒（货号：D026，南京建成科技有限公司）、总超氧化物歧化酶试剂盒（T-SOD货号：A001-1，南京建成科技有限公司）、丙二醛试剂盒（MDA货号：A003-1，南京建成科技有限公司）、兔抗大鼠MMP-2单克隆抗体（货号：BA0569，武汉博士德生物公司）、兔抗大鼠MMP-9单克隆抗体（货号：PB0710，武汉博士德生物公司）、兔抗大鼠TIMP-1多克隆抗体（货号：BA0575，武汉博士德生物公司）、兔抗大鼠TIMP-2多克隆抗体等（货号：BA0576，武汉博士德生物公司）、脱水机、包埋机（Leica，EG1140C）、石蜡切片机（Leica公司，RM2135）生物图像分析软件AON-STUDIO 2012等。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备

采用链脲佐菌素（STZ）腹腔注射制作糖尿病大鼠模型[6-7]。普通饲料适应性喂养1周后，禁食12 h，期间自由饮水，随机分为空白对照组9只，造模组27只，造模组按55 mg/kg剂量单次腹腔内注射STZ，空白对照组腹腔内注射等体积柠檬酸缓冲液，分别于72 h、1周后，采用葡萄糖氧化酶法尾静脉取血测定空腹血糖，两次空腹血糖均≥11.1 mmol/L，定义为糖尿病大鼠造模成功。第5周（STZ注射后第4周），空白组随机抽取1只大鼠，造模组随机抽取3只大鼠取材，光镜下观察空白组及造模组的心肌组织，若造模组表现为心肌细胞肥大、心肌间质纤维化，且心肌过碘酸雪夫染色呈阳性，可认为DCM造模成功。

1.2.2 实验分组及给药

大鼠32只，分为4组，其中包括空白对照组（Control）8只，将造模组24只随机平均分为3组，分别为模型组（Model）、糖心宁高剂量组（TXN-H）、糖心宁等效剂量组（TXN-L）。

糖心宁高剂量组和糖心宁等效剂量组每日中药灌胃1次，空白对照组、模型组予等量清洁饮用水灌胃，1次/d，按1 mL/100 g计算，共给药8周。

1.2.3 一般情况

平时记录大鼠活动状态、毛色、精神状态、饮食、二便情况。每周测血糖和称重。

1.2.4 标本采集

给药8周结束后，腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）将大鼠麻醉，腹主动脉取血，3 000 r/min离心15 min，分离血清，处死动物，迅速取出心脏，称取动物心重、称取左心室游离壁湿重，计算左室肥厚指数（LVHI左心室重量/全心湿重）。心脏保存于10%福尔马林溶液。

1.2.5 生化法测定氧化应激指标

采用硫代巴比妥酸法测定MDA的含量。用可见分光光度计测量其吸收度，通过公式计算MDA含量。具体操作按试剂盒说明书进行。采用黄嘌呤氧化酶法（羟胺法）测定T-SOD活力，通过比色法可以测定被测样品具有的T-SOD活力。具体操作按试剂盒说明书进行。

1.2.6 Masson染色测定心肌胶原含量

心肌组织常规脱水、包埋、切片，按照Masson染色说明说操作，光镜下观察心肌细胞，在200倍镜下拍片，每张片选10个视野，，采用生物图像分析软件AON-STUDIO 2012分析心肌组织胶原含量，测量胶原面积百分比（Percent）和积分光密度（IOD），结果用质量评分公式Q=P/I（Q：Quality、P：Percent阳性物质表达面积、I：IOD值）来评价心肌胶原的含量。

1.2.7 心肌MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1蛋白表达测定

采用免疫组化方法石蜡切片常规脱蜡至水，过梯度乙醇，PBS清洗后甩干，内源性过氧化物酶封闭消除背景染色，PBS清洗，浸入柠檬酸盐溶液，水浴锅加热法修复抗原，冷却至常温，正常山羊血清封闭非特异性抗原，PBS清洗甩干，滴加一抗小鼠一抗，4 ℃过夜。PBS泡洗、甩干，加入羊抗小鼠二抗，PBS洗片，DAB显色，封片，在400倍镜下拍片，每张片选10个视野。应用生物图像分析软件AON-STUDIO 2012对MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1（细胞质中棕褐色颗粒为阳性）表达进行图像分析，测量阳性物质的面积百分比（Percent）和积分光密度（IOD），结果用质量评分公式Q=P×I（Q：Quality、P：Percent阳性物质表达面积、I：IOD值）来评价蛋白表达情况。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism6.01软件进行数据分析，计算结果采用均数±标准差（mean±SD）表示，采用单因素ANOVA分析各组组间差异，2组间采用配对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

对照组大鼠体重随时间明显增加，精神状况良好，毛皮有光泽，反应灵敏。模型组大鼠均出现多饮、多食、多尿及消瘦等症状，毛皮杂乱、失去光泽，倦怠少动，反应迟钝，灌服中药组大鼠整体状况虽不及正常组，但较模型组有所改善。

糖尿病心肌病大鼠成模后，空腹血糖比对照组空腹血糖明显升高（P<0.01），差异有统计学意义；给药期间，各组血糖数值无明显波动；用药后，糖心宁组血糖与模型组血糖比较（P>0.05），差异无统计学意义。见表1。

2.2 左心室肥厚指数

模型组大鼠LVHI（0.73±0.08）明显高于对照组（0.61±0.06）（P<0.01），糖心宁高剂量组LVHI（0.64±0.06）和糖心宁等效剂量组LVHI（0.64±0.06）均低于模型组（P<0.05）。

2.3 T-SOD活力和MDA含量

模型组较对照组T-SOD活力显著下降，MDA含量升高（P<0.01）；而糖心寧高剂量和糖心宁等效剂量均可升高T-SOD活力（P<0.01），降低MDA含量（P<0.05）。见表2。

2.4 Masson染色结果胶原蛋白分析

模型组大鼠心肌胶原较对照组显著增多（Q：0.06±0.02比0.02±0.01，P<0.01）。糖心宁高剂量组（Q：0.02±0.01比0.06±0.02，P<0.01）及糖心宁等效剂量组（Q：0.03±0.0.03比0.06±0.02，P<0.05）均可降低心肌胶原。所有数值均采用科学计数（10-2）法表示。见图1。

2.5 大鼠心肌MMP2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1蛋白表达

大鼠心肌MMP2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1蛋白表达情况见表3，MMP-2见图2，MMP-9见图3，TIMP-2见图4，TIMP-1见图5。

2.6 各组大鼠 MMP-2与TIMP-2、MMP-9与TIMP-1蛋白含量比值比较见表4。

3 讨论

DCM心室重构包括心肌细胞肥大、心肌间质纤维化和心肌细胞凋亡，糖尿病时高血糖诱导的氧化应激是心肌损伤的主要机制之一[8-9]，氧化应激可通过调节MMPs/TIMPs的平衡参与DCM心肌损伤，促进心肌间质纤维化，而心肌间质纤维化是糖尿病心肌病心室重构的病理特点之一。心肌细胞外基质最主要的成分是胶原，其中Ⅰ型、Ⅲ型胶原占90%以上，MMPs是降解细胞外基质的关键酶，MMP-2和MMP-9是心肌组织I、III型胶原完全降解的限速酶，决定I、III型胶原降解的速度[10-11]。TIMPs为MMPs内源性的特异性抑制剂，与MMPs共同构成体内调节细胞外基质动态平衡的最重要的系统，目前发现与MMP-2和MMP-9关系密切而且在心脏表达较多的是TIMP-1、TIMP-2；TIMP-1主要抑制MMP-9，TIMP-2主要抑制MMP-2[12]。

现代医学目前尚无治疗DCM的特异性药物，临床主要以纠正糖、脂代谢紊乱，控制血压，保护心肌细胞等对症综合治疗为主，尤其是纠正糖、脂代谢紊乱是治疗DCM的关键环节。高额的治疗费用和化学药物所带来的不良反应使上述药物的临床获益受限，因此，加强传统中医药学在相关领域的研究，具有重要临床意义。

中医虽无DCM的明确记载，但对其症状与病机的描述可见于“消渴病”并发“心悸”“怔忡”“胸痹心痛”“厥心痛”“真心痛”等证之中。“瘀血”在糖尿病心肌病的发生、发展中起着至关重要的作用。消渴病迁延日久，气阴两虚，气虚无力推动血行，阴虚脉道不充，则更易导致瘀血阻滞；瘀血一旦形成，即成为新的致病因素，如血瘀气滞可影响水津的输布和吸收，水液停蓄成痰，形成瘀痰互结，痹阻心脉，故目前多以以益气养阴活血法为DCM基本治疗大法[13-14]。糖心宁由太子参、麦冬、五味子、丹参、川芎、香附、香橼、佛手、牡丹皮、赤芍、黄连组成。方中以太子参、麦冬、五味子益气养心，以香附、香橡、佛手宽胸理气，配以丹参、川芎活血通脉，牡丹皮、赤芍凉血清热，黄连厚肠理气，诸药相伍，共奏益气养心、理气通脉、凉血清热之功，具有良好的临床疗效。

本研究发现，模型组大鼠左心室肥厚指数升高，MDA含量增多、T-SOD活力下降，提示氧化应激参与了糖尿病心肌病心室重构的发生和发展；而MMPs/TIMPs在模型组和对照组之间也存在差异，模型组比值有下降趋势，尤其以MMP9/TIMP1比值降低明显，提示MMPs和TIMPs失衡可能是糖尿病心肌病心室重构的发病机制之一，且氧化应激与MMPs/TIMPs平衡可能存在一定的联系。应用糖心宁后，能够降低左心室肥厚指数，提高T-SOD活力，减少MDA含量，升高MMPs/TIMPs比值，尤以MMP9/TIMP1比值升高明显，达到保护心肌的目的。

研究结果提示糖心宁可以降低左心室肥厚指数，减轻DCM心室重构，实现途径与改善氧化应激反应，减弱TIMP-1对MMP-9的抑制密切相关。至于糖心宁其他减轻心肌细胞损伤具体作用环节及其改善心室重构的分子通路机制尚有待进一步研究。

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（2016-12-20收稿 责任编辑：洪志强）

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