近10年脾肾阳虚证动物模型研究述评

关键词：动物模型；脾肾阳虚证；综述

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.06.044

中图分类号：R228 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）06-0126-04

中医动物模型主要包括依据中医传统病因制备的动物模型和模拟西医病因病理制备的动物模型。近年来，随着中医研究的具体化和规范化，研究人员越来越清楚地认识到中医“证”本质研究大多停留于临床而未能进一步深入，制约了中医研究的发展。为此，中医“证”本质的研究已逐渐成为热点，而中医“证”的动物模型制备也因此受到越来越广泛的关注。

目前，“病”的动物模型制备有较明确的方法、验证模型的制备是否成功也有特异的理化指标。而中医证候是指疾病发展到一定阶段时对病性、病势的概括，是机体内因和环境外因综合作用的机体反应状态。证候的存在并非固定，会随着病情发生变化；而实验动物与人类在生理结构、组织功能等方面存在巨大差异，所以，中医“证”的动物模型制备迄今尚无明确的方法，也没有特异性理化指标和明确的判定标准。为此，笔者以脾肾阳虚证动物模型为例，将近10年来相关制备方法进行归纳、分析和总结，以期对今后的研究有所启迪。

1 造模方法

1.1 药物诱导造模法

1.1.1 中药 中医认为，寒为阴邪，易伤阳气。据此，造模过程中长期给予实验动物苦寒泻下中药，使之日久伤阳，最终出现脾肾阳虚证的症状。孙氏等[1]予大鼠15%大黄粉悬液灌胃，给药量8.9 g/（kg·d），连服9 d。结果大鼠出现精神萎靡、倦卧、畏寒、活动频度下降、皮毛枯槁、纳呆、消瘦、便溏、脱肛及肛门红肿等脾肾阳虚证的表现。

1.1.2 中西药混合 本法主要利用苦寒泻下中药和对机体（主要是肾脏）有毒副作用的西药，分别制备脾阳虚模型和肾阳虚模型，二者合而为一，共同完成脾肾阳虚证动物模型的制备。

黄氏等[2]给予雄性大鼠腺嘌呤350 mg/（kg·d）、苦寒中药（龙胆、番泻叶、栀子）煎剂4 mL/（kg·d）混合灌胃，连续2周。结果大鼠出现精神不振、蜷缩、摄食减少、身体消瘦、尿量减少、体毛无光泽、大便稀烂等脾肾阳虚证候。

赵氏等[3]分2个阶段进行造模。第一阶段14 d，制备脾阳虚证模型。大鼠上午灌服200%大黄水煎液，2 mL/（只·d），下午灌服蒸馏水2 mL/（只·d）；第二阶段10 d，在第一阶段基础上继续制备肾阳虚证模型，大鼠肌肉注射氢化可的松25 mg/（kg·d），并灌服蒸馏水3 mL/（只·d）。结果大鼠于造模第2日即出现便溏，之后逐渐加重，体质量增长缓慢，精神日渐萎靡；第14～25日时，脾肾阳虚症状更加明显，出现体质量减轻、身体瘦削、毛发枯燥松弛、肢冷、喜蜷缩扎堆、目光无神、眯眼或闭眼、反应迟钝、少动或行动迟缓、叫声低而无力、饲食和饮水量减少，小便次数及小便量增多等现象。

1.1.3 西药 有部分研究人员使用单一的西药制备脾肾阳虚证动物模型。如王氏[4]按10 mg/（kg·d）剂量给予大鼠0.1%丙基硫氧嘧啶。l周后，大鼠开始出现精神萎靡、目光无神欲闭、少动嗜睡、活动迟缓、反应迟钝、畏寒蜷卧、弓背、喜聚堆、皮肉松懈，尾巴发凉，反抗力变小、竖毛、体毛无光泽且易脱落等脾肾阳虚证候；2周左右表现尤为突出，甚至可见眼、鼻、唇、耳、尾部色淡失泽。

1.2 药物诱导联合其他辅助刺激造模法

中医认为，湿为阴邪，易伤阳气；劳力过度可耗伤精气，导致脏腑功能减退。因此，制备脾肾阳虚证动物模型可将动物置于湿冷环境，或通过无休止的运动使其劳累过度，以达到预期造模效果。此外，对于脾阳虚证，长期饮食不节，耗伤脾气也是原因之一。

1.2.1 中药和环境共同刺激 屈氏[5]按2 mL/kg剂量，予雄性大鼠100%番泻叶溶液灌胃，每日1次；灌胃半小时后用喷雾器给每只大鼠全身均匀喷洒4 ℃冷水50 mL，湿润皮毛，之后再将大鼠置于电风扇前（1400 r/min）30 min，吹干皮毛，造模周期为10周。结果大鼠出现精神不振、安静少动、喜欢扎堆、体毛无光泽、身体消瘦、便溏、捕捉时抵抗减弱及体温降低等脾肾阳虚证候。

1.2.2 中西药、疲劳刺激和饮食共同刺激 王氏等[6]在前2周，每日上午给予雄性大鼠丙基硫氧嘧啶悬浊液1 mg/100 g灌胃，下午再将大鼠置于38 ℃恒温水浴箱中游泳，直至疲劳（疲劳标准为大鼠全身下沉至没颈，不能坚持游泳）；在此基础上，单日喂饲甘蓝10 g/只，双日喂精炼猪脂2 mL/只。从第3周开始，在前2周操作不变的前提下，再每日给予100%番泻叶水浸液灌胃，2 mL/只，直至第4周实验结束。结果从第2周开始大鼠活动减少，开始出现毛发无泽、爪甲颜色较浅、大便较稀软的现象。第3周时，大鼠出现大便清稀、甚者如水状，爪甲颜色变淡，毛发枯萎无华，尾巴变凉，弓背倦怠，喜扎堆等现象。第4周时，大鼠上述状态较第3周更甚，且饮食、饮水量明显降低，游泳持续时间为正常大鼠的1/2，表明造模后大鼠的体力、能量代谢较正常大鼠降低。

1.3 其他造模法

有学者通过筛选自然衰老大鼠，从中获取存在脾肾阳虚证表现的大鼠，直接作为动物模型[7]；或通过手术切除部分或全部动物内分泌组织（包括肾上腺、甲状腺、睾丸及卵巢等），并与其他方法相结合，共同制备脾肾阳虚证动物模型[8]。赵氏等[9]采用单肾切除术加腺嘌呤灌胃法制备慢性肾衰竭大鼠模型，结果大鼠随着肾衰程度加重而日渐消瘦，出现生长抑制、体质量减轻、体毛干枯发黄不齐且易脱落、畏寒拱背、精神萎靡、活动减少、尾部及耳廓苍白、便稀等症状，符合脾肾阳虚证的临床表现。

2 述评

2.1 模型评价标准

目前，肾阳虚证动物模型的症状诊断标准主要依据《中医虚证辨证参考标准》[10]肾阳虚诊断标准，即出现体质量下降、体温下降、活动减少、反应迟钝、弓背蜷缩、畏寒、体毛枯疏、失去光泽、采食量、饮水量减少等症状。脾阳虚证动物模型的外观表现不少与肾阳虚类似，如食欲减退，体质量减轻，体温下降，大便溏泻，倦怠嗜卧，喜扎堆，毛色不荣，个别动物脱肛，甚至死亡[11]。

2.2 造模原理

2.2.1 依据中医病因病机理论 脾阳虚证是指脾阳虚衰，阴寒内盛所表现的证候，多由脾气虚所致，或饮食生冷肥甘，或过用寒凉药物，或久病失养，导致脾阳不振，运化无权，症见面黄少华、中脘觉冷、泛吐清水、纳少腹胀、食入尤甚、喜热饮、便溏，或见肌肉瘦削、四肢不温、少气懒言等。肾阳虚证主要由禀赋薄弱，久病不愈，或房劳伤肾，下元亏损，命门火衰所致，症见面色淡白、腰酸腿软、阳痿、头晕耳鸣、形寒尿频等。而脾肾阳虚证，则是脾肾两脏阳气皆亏虚所表现的证候，多由脾肾久病，耗气伤阳，或久泻久痢，或水邪久居，致肾阳虚衰不能温养脾阳，或脾阳久虚不能充养肾阳，终导致脾肾阳气俱伤而成。目前运用的苦寒泻下中药（大黄、番泻叶等）伤阳、或制造寒凉潮湿的外界环境（冷水湿身）、或使大鼠劳力过度伤及脾肾（长时间游泳直至疲劳）等方法皆是据此原理制备脾肾阳虚模型。

2.2.2 利用西药的毒副作用 利用西药毒副作用造模主要是制备肾阳虚模型。现代医学研究认为，中医的“肾”不是单一器官的单一功能，而是多器官、多功能集成化产物，实际反映了人体整体功能的一个侧面，其肾本质可能是以下丘脑-垂体-靶腺功能轴的功能状态为主，并与免疫功能、能量代谢、肾脏分泌功能、微量元素以及微循环、核酸代谢等有一定的关系[12]。因此，可以通过西药产生的毒副作用打乱动物本身正常的激素负反馈，破坏肾上腺皮质轴、甲状腺轴、性腺轴的功能，以模拟肾阳虚病理损伤[13]。

腺嘌呤是核酸的主要组成成分之一，当机体摄入大剂量腺嘌呤时，其代谢产物会对睾丸生殖细胞及间质细胞有直接毒性作用，使睾丸组织萎缩，大部分曲细精管退行性变化，精子产生减少或缺损，影响睾丸生精功能及产生雄性激素的功能，从而出现类似肾阳虚的症状[14]。

大剂量外源性糖皮质激素（如氢化可的松等）能反馈性抑制腺垂体促肾上腺皮质激素的释放，从而抑制糖皮质激素的释放，当突然停用糖皮质激素，肾上腺皮质轴的抑制状态即暴露出来，使动物出现一系列“耗竭”现象，按照中医脏腑辨证标准，类似于肾阳虚的临床表现[15]166。

硫脲类药物可抑制甲状腺激素合成，使甲状腺功能减退，临床上以畏寒、汗少、动作缓慢、精神萎靡、记忆力减退、肌肉无力、嗜睡、性功能减退等为主要表现，呈现一派肾阳不足之象，故用此法来制备肾阳虚动物模型[16]。

D-半乳糖在一定时间内连续给动物大剂量注射，会使机体细胞内半乳糖浓度增高，在醛糖还原酶的催化下还原成半乳糖醇，这种物质不能被细胞进一步代谢，从而堆积在细胞内，影响正常渗透压，使细胞肿胀，引起机体多器官、多系统功能障碍，最终导致衰老的发生，进而出现一系列因衰老而致肾阳虚的症状[17]。

西药制备中医“证”模型的原理，并不完全符合中医病因病机理论，且目前的模型验证方法又多停留在对某些理化指标检测上，缺乏可靠的阳性药物反证，故无法确定西药造模对实验动物的影响与中医脾肾阳虚证相同；此外，某些西药在模型制备过程中对动物性别有选择，这大大降低了西药诱导造模法的普遍性，影响实验结果。

2.3 造模方法

药物诱导造模法操作简单、方便，对实验人员操作水平、实验室设备、实验场地等要求较少，因而被大多数学者所采用。其中，中药诱导造模法因完全符合脾肾阳虚证的中医病因病机，属传统脾肾阳虚证动物模型制备方法，在早期即被广泛采用。但随着中医实验动物学的发展，研究人员在实际操作时，发现其中存在用药剂量不易掌握、造模周期长、部分动物易耐受及阳性症状不易表现等缺点，故而近些年来已逐渐被中西药混合诱导造模法所替代。

中西药混合诱导造模法取中药、西药之所长，共同制备脾肾阳虚证动物模型。但在西药的选择上也存在一些弊端。以氢化可的松为例，首先其造模剂量不易控制，剂量过小不仅不会出现肾阳虚证候，反而会使动物使体内激素水平升高，产生类似于肾上腺皮质功能亢进的肾阴虚的证候[15]166-168。其次，氢化可的松本身存在治疗作用，因此，在制备如“脾肾阳虚证溃疡性结肠炎病证结合”动物模型时，会影响实验结果。

辅助刺激造模法大多也是依据中医病因病机理论制备脾肾阳虚证动物模型，如将动物置于寒凉环境、或使其劳力过度、或饥饱失常喂养使其饮食失节等。将它与单纯的药物诱导造模相结合，可缩短造模周期、提高造模成功率，同时也便于不同条件和要求的研究人员进行选择，以达到最佳造模效果。

有些学者通过选择自然衰老而具有脾肾阳虚症状大鼠以直接获取模型，此法看似简便，也符合脾肾阳虚证的中医病因病机，但当实验样本量较大时，筛选工作变得繁琐；且实验动物存在个体差异，无法保证每只自然衰老动物都会出现同等程度脾肾阳虚症状，故而影响实验结果的稳定性及可靠性。

此外，一些学者采用的手术切除与其他方法相结合制备脾肾阳虚证动物模型，其效果虽然明显，造模周期也较短，但对实验人员及设备、场地的要求较高，稍有不慎便会导致实验动物死亡；且中医理论体系中的脏腑是一个宏观、整体、系统的概念，不能完全等同于西医理论中的单个脏器。已有学者认为本法会引发一些不可逆改变，可能使药物失去治疗作用，进而影响整个实验结果[18]。因此，通过此法制备出的“脾肾阳虚证”是否完全等同于中医理论中的脾肾阳虚证，还有待进一步研究。

3 展望

目前，在制备中医证型动物模型时，研究人员大多遵循传统的中医病因病机理论，但随着研究的不断深入，传统单因素中药或西药诱导造模法逐渐被淘汰，取而代之的是多因素造模法，即由单纯药物诱导造模向物理、化学及心理应激等多方面诱导造模转变；同时，造模思路也由单纯符合症状表现立意，向考虑证与个体发生学关系、证与体质基础关系以及证与心理应激关系的方向发展[19]。

笔者认为，今后中医证型动物模型构建标准应涵盖以下几方面：①突出中医药特色；②代表性与实用性；③系统性与先进性；④创新性与科学性；⑤模型重复性高。总之，开展“中医证型”动物模型实验研究，除提倡创新性，更应重视合理性和成功性，将中医药学的原创思维、原创优势、独特的辨证论治体系、临床思维方法与以科学实验为基础的现代医学相结合。

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