高效氯氰菊酯对草鱼血清和脾脏酸性磷酸酶活性的影响

摘要：研究了暴露在不同浓度高效氯氰菊酯下草鱼（Ctenopharyngodon idellas）血清和脾脏中酸性磷酸酶（ACP）的活性变化。将高效氯氰菊酯浓度设5组，包括1个对照组（0 μg/L）和4个处理组（0.5、1.0、3.0、5.0 μg/L），每组分别于暴露1、5、12 d时取样，测定血清和脾脏ACP的活性。结果显示，暴露1 d时，血清ACP活性各处理组显著下降；脾脏ACP活性0.5 μg/L组和1.0 μg/L组显著升高，3.0 μg/L组和5.0 μg/L组显著下降。暴露5 d时，血清ACP活性1.0 μg/L组显著上升，3.0 μg/L组和5.0 μg/L组显著下降；脾脏ACP活性1.0、3.0和 5.0 μg/L组显著下降。暴露12 d时，血清ACP活性1.0、3.0和5.0 μg/L组显著下降；脾脏ACP活性各处理组均显著下降。ACP活性的变化反映了高效氯氰菊酯能够影响鱼体的代谢平衡，对鱼体具有毒害作用；同时，血清和脾脏的ACP活性对高效氯氰菊酯早期污染的敏感性可以作为监测水体中此类化学品污染的一个特异性标志物。

关键词：高效氯氰菊酯；草鱼（Ctenopharyngodon idellas）；酸性磷酸酶；血清；脾脏

中图分类号：Q556+.1；S965.112 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）07-1620-03

菊酯类农药因较有机磷、有机氯农药对哺乳动物和鸟类的毒性低，且具有广谱、高效的优点，而被广泛应用于农业、林业和家庭病虫害控制中；在水产养殖方面也被用来杀灭鱼体表面的甲壳类寄生虫和控制有害水生昆虫的过度繁殖[1]。但是，菊酯类农药的过量使用和随意排放，可能会被冲刷到附近的水体中，进而对水环境造成污染。即使在非常低的浓度下，菊酯类农药也会对淡水鱼类和其他非靶标水生生物产生极大的毒害[2]。因而，评估菊酯类农药对非靶标水生生物的毒性作用成为研究的热点[3，4]。酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）（EC 3.1.3.2）是一种对鱼类的生理代谢有着重要影响的酶，通过研究高效氯氰菊酯对鱼类ACP活性的影响，有助于揭示鱼体对菊酯类农药的响应机制。国外在高效氯氰菊酯对鱼类代谢的影响方面开展了大量研究[5，6]，而关于鱼类体内ACP的研究则较少，国内在这方面更是鲜见报道。草鱼（Ctenopharyngodon idellas）是我国主要的淡水养殖鱼类之一，具有重要的经济价值。因此，探讨高效氯氰菊酯对草鱼ACP活性的影响，可以为水环境质量监测和渔业生产的健康发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

同批繁殖、同池培育的健康草鱼，体重（100±10） g，体长（15±2） cm。高效氯氰菊酯为上海永远化工有限公司产品，对硝基苯磷酸二钠（pNPP）为BBI公司产品，牛血清白蛋白（BSA）为AMRESCO公司产品。

1.2 方法

1.2.1 草鱼适应性驯化 将试验用草鱼放入容积为200 L（100 cm×50 cm×40 cm）的养殖箱中驯养7 d，养殖用水为曝气后的自来水，水温（25±2） ℃，每3 d换水1次，增氧机增氧，定时投喂饵料。

1.2.2 高效氯氰菊酯暴露处理 通过常规急性毒性试验[7]测出高效氯氰菊酯对草鱼96 h半致死浓度（LC50）为6.1 μg/L。据此，将试验分为4个处理组和1个对照组（CK），每组40尾草鱼，每组设2个平行。处理组高效氯氰菊酯浓度依次为0.5、1.0、3.0、5.0 μg/L，以4.5%的高效氯氰菊酯乳油和曝气后的自来水配制；对照组不加高效氯氰菊酯，用曝气后的自来水配制。试验水温23～27 ℃，pH 7.3～7.8，溶氧≥4 mg/L，每天更换1/3试验液，保证各组试验液浓度基本不变。试验开始前1 d停止投饵。试验开始后，于1、5、12 d分别从各组随机取10尾鱼，用于ACP活性的测定。

1.2.3 血清和酶粗提液制备 从草鱼鳃动脉采血，每尾取血1 mL置于2.5 mL离心管中，4 ℃下放置24 h分离血清，并于4 ℃下保存待测。采血后迅速解剖鱼体，取出脾脏，用生理盐水冲洗，滤纸吸干，按1∶19的质量体积比加入0.9%的NaCl，冰浴匀浆；4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清液，分装并储存于-20 ℃待测。

1.2.4 粗提液蛋白质定量测定 蛋白质定量测定参照Bradford[8]的方法。

1.2.5 ACP活性测定 ACP活性采用Tenniswood等[9]的方法进行测定。酶活性单位定义：28 ℃下反应体系中每毫升血清或每克蛋白质在15 min内催化对硝基苯磷酸二钠生成1 mg对硝基酚的酶量为1个酶活单位（U/mL或U/g）。

1.3 数据处理

试验数据以平均值±标准差表示，采用Excel 2003软件作图，并进行One-way ANOVA分析和独立性t检验，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 高效氯氰菊酯对草鱼血清ACP活性的影响

不同浓度高效氯氰菊酯暴露下草鱼血清ACP活性的变化如图1所示。由图1可知，对照组在1、5、12 d时血清ACP活性变化不大。暴露1 d时各处理组ACP活性与对照组相比，0.5 μg/L组和1.0 μg/L组显著下降，3.0 μg/L组和5.0 μg/L组极显著下降；暴露5 d时各处理组ACP活性与对照组相比，0.5 μg/L组无显著变化，1.0 μg/L组极显著上升，3.0 μg/L组显著下降，5.0 μg/L组极显著下降；暴露12 d时各处理组ACP活性与对照组相比，0.5 μg/L组无显著变化，1.0 μg/L组和3.0 μg/L组显著下降，5.0 μg/L组极显著下降。

2.2 高效氯氰菊酯对草鱼脾脏ACP活性的影响

不同浓度高效氯氰菊酯暴露下草鱼脾脏ACP活性变化如图2所示。由图2可知，对照组在1、5、12 d时脾脏ACP活性变化不大。暴露1 d时各处理组ACP活性与对照组相比，0.5 μg/L组显著升高，1.0 μg/L组极显著升高，3.0 μg/L组显著下降，5.0 μg/L组极显著下降；暴露5 d时各处理组ACP活性与对照组相比，0.5 μg/L组无显著变化，其他处理组极显著下降；暴露12 d时各处理组ACP活性与对照组相比，0.5 μg/L组显著下降，其他处理组极显著下降。

3 讨论

ACP是一类在酸性条件下催化磷酸酯水解的酶，在鱼类各组织器官中广泛分布，包括溶酶体性和非溶酶体性两大类；溶酶体性ACP主要存在于巨噬细胞，定位于溶酶体内[10，11]，是溶酶体的特征性酶，主要参与磷酸酯的代谢，与细胞的消化、自溶和免疫有关。非溶酶体性ACP与细胞增殖、能量转化、质膜的吸收与运输功能等一些重要的生物学功能有关[12]。由于ACP参与了环境污染物对生物产生的细胞毒性和遗传毒性的适应性反应，可作为检测环境污染程度的生物标志物[13]。

血液生化参数是鱼体健康状况的主要指标，也是鱼类疾病诊断的依据之一，能够反映其健康状况和生理状态，血清生化分析可用于监测早期氯氰菊酯对鱼类的毒性[14]。本试验中，草鱼在低浓度（0.5 μg/L）高效氯氰菊酯下暴露1 d，血清ACP活性显著下降，表明草鱼对高效氯氰菊酯的敏感性较高，可以作为监测养殖水域中高效氯氰菊酯早期污染的一个生物指标。血清中的ACP主要来源于血细胞[15]，在暴露1 d时，各处理组血清ACP活性均受到显著抑制，可能是草鱼机体来不及对胁迫作出适应性反应所致；而暴露5 d时，1.0 μg/L组血清ACP活性极显著上升，表现出了在毒物的诱导作用下机体产生的代偿性反应。Instioris等[16]的研究发现，高效氯氰菊酯的胁迫会导致鱼体血细胞比容下降。因此，随着胁迫强度的持续加强，可能会由于血细胞比容的下降，引起向血清分泌的ACP量下降，进而导致了血清ACP活性的下降。

高效氯氰菊酯对鱼类具有极大的毒性，可以阻碍神经冲动的正常传导，对鱼体生理机能造成极大影响[17]。脾脏是鱼类的主要免疫器官，它的生理状况可以反映出鱼体的健康状况。在短时间（1 d）暴露下，草鱼脾脏ACP活性表现出较低浓度（0.5 μg/L和1.0 μg/L）下的诱导和较高浓度（3.0 μg/L和5.0 μg/L）下的抑制，这可能与脾脏的功能有关，作为鱼体对刺激的应答反应，较低浓度下产生了代谢补偿，使机体具有一定的耐受能力；但较高浓度或长时间的暴露超出了鱼体的调节能力，引起机体功能的失常。

本研究发现，草鱼血清和脾脏的ACP活性对高效氯氰菊酯具有较高的敏感性，可以作为监测水环境中高效氯氰菊酯早期污染的生物指标；高效氯氰菊酯的胁迫对草鱼血清和脾脏ACP活性的显著影响，表明高效氯氰菊酯能够对草鱼生理代谢产生明显影响，对草鱼具有较强的毒性。

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