雌核发育抗病草鱼与普通草鱼的免疫学指标比较

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摘要：雌核发育抗病草鱼在养殖过程中已表现出较好的抗病能力，但对其抗病力的确定还缺乏有力的证据。通过对雌核发育抗病草鱼和相同饲养条件下普通草鱼的主要免疫球蛋白基因（lgD、IgZ和IgM）相对表达量、免疫生化指标（白蛋白、碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶和肌酐）、血清溶茵酶活性等相关参数的比较，分析了雌核发育抗病草鱼的免疫能力。数据显示雌核发育抗病草鱼IgZ、IgM mRNA在血液和脾脏中的相对表达量、IgD mRWA在头肾和脾脏中的相对表达量都与普通草鱼存在显著差异（P<0.05）；溶菌酶活性与普通草鱼存在显著差异（P<0.05）。在免疫生化指标方面，雌核发育抗病草鱼也明显优于普通草鱼。研究结果肯定了雌核发育抗病草鱼在免疫机能方面的优越性。

关键词：雌核发育草鱼；免疫；免疫球蛋白（Ig）；溶菌酶

中图分类号：Q955 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）03-0213-05

草鱼（Ctenopharyngodon， idellus）是我国“四大家鱼”之一，它具有生长速度快、肉质好、容易养殖等特点，因其饲料来源广，故极适合在广大农村养殖[1]。但是草鱼抗病能力较差，特别是在一龄、二龄阶段。据统计：在全国范围内，当年鱼苗养殖平均成活率不超过50%，而二龄草鱼养殖发病率又很高，常给养殖户带来重大的经济损失。虽然多年来科技工作者一直致力于草鱼疾病预防与治疗的研究，但因其抗病力差，并未从根本上解决草鱼养殖中病害多、死亡率高的难题。湖南师范大学鱼类发育生物学团队在四倍体鲤鲫[2]的研制基础上开展了雌核发育抗病草鱼[3，4]的培育和育种研究，从目前江苏省实际养殖情况分析，与普通草鱼相比，雌核发育抗病草鱼养殖成活率提高50%，生长速度快10%～15%。

国内学者对于草鱼抗病方面的研究已经有了较多的报道。李耀国等[5]和苏建明等[6]做了关于转基因抗病草鱼研究进展的报道。黄贝等[7]对斜带石斑鱼（Einephelus coioides）IgM、IgZ和IgD蛋白重链基因的克隆进行了探究。关于雌核发育抗病草鱼多方面免疫机能与普通草鱼比较的报道尚属罕见。此外，对于培育的各种抗病鱼类，目前还缺少一个全面、准确的免疫性能评估体系。本文从免疫球蛋白基因相对表达量、免疫生化指标和血清溶菌酶活性等方面对抗病草鱼的免疫性能进行了较为全面的研究，并与同等条件下的普通草鱼进行了分析对比，发现了雌核发育抗病草鱼在免疫机能方面的优越性。研究结果可为该品种后期的推广养殖提供支撑材料，同时也为其他经济鱼类的抗病育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

试验用雌核发育抗病草鱼与普通草鱼均来自江苏省阳澄湖养殖基地，雌核发育草鱼与普通草鱼各3组，每组选取体质健康，规格整齐的草鱼6尾。

1.2试验方法

1.2.1 总RNA的提取和cDNA的合成

活体解剖取出头肾和脾脏等组织，在用二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理水配制的磷酸缓冲液（PH 7.4）中漂洗，经过液氮冷冻后，放于-80 0C保存，用于总RNA的提取。血液的采集通过已加入灭菌抗凝剂的注射器从尾静脉抽取，于4 0C 10 000 r/min离心10 min后收集血细胞，经过液氮冷冻后，放于-80 0C保存。

用RNAiso Plus （Takara）提取各组织的总RNA，用DNA酶（Dnase I Rnase Free，Takara）消化后，溶于20 μL RNase-free的水中，经紫外分光光度计检测RNA的浓度、1010的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性后，取3μg总RNA按照Prime-ScriptⅢlst Strand cDNA Synthesis Kit （Takara）说明书合成cDNA第一链，-20 0C保存备用。

1.2.2引物设计

根据NCBI上已收录的草鱼免疫球蛋白基因IgD（ GQ429174.1）、IgZ（ GQ201421.1）和IgM（DQ-417927.1），用Primer Premier 5.0设计荧光定量PCR引物，如表1所示。

1.2.3 Real-time荧光定量PCR分析

将各组织和血液的cDNA模板进行梯度稀释，用草鱼免疫球蛋白基因引物和β-actin引物，以SYBR Premix Ex TaqTM （TaKaRa， Dalian， China）试剂盒提供的试剂在Bio-Rad CFX96 Real-timePCR System上进行定量PCR。反应体系如下：SYBR Premix Ex Taq"nvi 10μL，荧光定量PCR引物（2μLmol/L）各1.6μL，cDNA模板2μL，灭菌蒸馏水4.8μL。反应程序为95 °C 10 s；95 °C 5 s.60 °C 30 s，40个循环；每次反应都通过从95 °C降至60 °C（每10 s降0.5℃）绘出溶解曲线。每次反应都以无菌水作为空白对照。

结果计算采用LIVAK等[8]的2-A△Ct方法进行，目的基因mRNA的表达量经与卢-actin，比较后，再与对照样品进行相对定量。所得数据以平均值±标准误（x±sx）表示，用GraphPad 5.0绘制草鱼免疫球蛋白各基因相对表达量直方图。

1.2.4血清溶茵酶活性差异

1.2.4.1血清的制备

分别对雌核发育抗病草鱼和普通草鱼进行尾静脉采血，4 0C 3 500 r/min离心15 min，收集血清保存于-80 0C待测。

1 .2.4.2血清溶菌酶活性的测定

采用溶菌酶检测试剂盒（南京建成科技公司）进行溶菌酶活性的测定。将配好的应用菌液、标准品液及所需检测的样本均放人37 °C水浴箱中预温5 min以上，使菌液、标准液及检测样本的温度达37℃。在波长530 nm处，1 cm光径比色皿，以双蒸水调透光度100010后，往相应编号的试管中加入200 μL待测样本或标准品，取2 mL应用菌液迅速冲入试管中，立即混匀，开始计时。之后将其迅速倒人比色皿中，在530 nm处比色，在Ss和2 min 5 s时分别读取透光值。按下式计算溶菌酶含量：

溶菌酶含量（mig/L）=（测定透光度一测定透光度）/（标准透光度一标准透光度）×标准品浓度×样本测试前稀释倍数。

1.2.5 血清中免疫生化指标的测定

分别对雌核发育抗病草鱼、普通草鱼进行尾静脉采血，4 0C 3 500 r/min离心15 min，收集血清，于美国雅培C一8000全自动生化分析仪上进行白蛋白、碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶和肌酐的测定。

2 结果与分析

2.1 雌核发育抗病草鱼与普通草鱼组织血液中免疫球蛋白基因的表达差异

实时荧光定量RT-PCR结果表明，雌核发育抗病草鱼血液和脾脏中免疫球蛋白IgZ转录本丰度明显高于普通草鱼（P<0.05）（图1），其中血液中IgZ mRNA的表达量约为普通草鱼的2倍；头肾中IgZ的转录本丰度略高于普通草鱼，但差异不显著（P>0.05）。

雌核发育抗病草鱼血液中免疫球蛋白IgM转录本丰度明显高于普通草鱼（P<0.05），约为普通草鱼的2倍；脾脏中IgM的转录本丰度显著高于普通草鱼（P<0.05），而两者头肾中IgMmRNA表达量相当，差别不大（图2）。

雌核发育抗病草鱼头肾中免疫球蛋白IgD转录本丰度明显高于普通草鱼，约为普通草鱼的8倍（_P<0.01）；脾脏中IgD的转录本丰度高于普通草鱼（P<0.05），而两者血液中IgD的mRNA表达量相当，差别不大（图3）。

2.2雌核发育抗病草鱼与普通草鱼血清中溶菌酶活性的差异 分别对雌核发育抗病草鱼和普通草鱼血清中的溶菌酶含量进行了测定，结果如图4所示。抗病草鱼血清中溶菌酶含量明显高于普通草鱼，差异显著（P<0.05）。

2.3雌核发育抗病草鱼与普通草鱼血清中免疫生化指标的差异

免疫生化参数的比较如表2所示，雌核发育抗病草鱼血清中白蛋白含量约为普通草鱼血清中白蛋白含量的4倍，差异极为显著（P<0.01）；碱性磷酸酶含量约为普通草鱼的9倍，差异极为显著（P<0.01）；谷丙转氨酶在雌核发育抗病草鱼血清中的含量显著高于普通草鱼，差异极为显著（P<0.01）。谷草转氨酶在雌核发育抗病草鱼血清中的含量略高于普通草鱼，但差异不显著（P>0.05）；而血清中肌酐的含量两者差异不大。

3讨论

3.1雌核发育抗病草鱼与普通草鱼组织与血液中免疫球蛋白基因的表达差异

免疫球蛋白（Ig）是脊椎动物在对抗抗原刺激的免疫应答中，由B淋巴细胞产生的一类特异性识别并中和相应抗原的具有免疫功能的球蛋白[9J。不同类别的Ig都含有4条对称的多肽链构成的“Y”字型结构的基本单位[1O，11]。本研究以实时荧光定量RT-PCR技术对抗病草鱼和普通草鱼在IgM、IgD和IgZ mRNA的相对表达量上进行了比较研究。结果发现，雌核发育抗病草鱼在血液和脾脏中IgZ、IgM mRNA的相对表达量以及脾脏和头肾中IgD mRNA的相对表达量与普通草鱼存在显著差异（P<0.05），上述结果证实了雌核发育抗病草鱼在免疫性能上要优于普通草鱼。但是雌核发育抗病草鱼与普通草鱼在头肾中的IgZ、IgM，血液申的IgD mRNA相对表达量上无显著性差异。这可能与免疫球蛋白的功能差异有关。郝贵杰等[12]和吕翠等[13]研究表明，IgM由B细胞分泌，出现于血液和其他体液，作为免疫效应分子存在；IgZ在草鱼粘膜免疫中发挥重要的作用。因此在脾脏和血液中能较为敏感地检测到这两种免疫球蛋白的表达差异。雌核发育抗病草鱼相对于普通草鱼脾脏和血液中极高的IgZ和IgM mRNA表达量，说明在效应分子及粘膜免疫方面具有极大优势。关于鱼类IgD的功能研究较少，目前普遍接受的观点是IgD能作为淋巴细胞膜上的特异性抗原受体[141。B淋巴细胞主要集中在头肾和脾脏中，这为雌核发育抗病草鱼脾脏和头肾中IgD mRNA的高表达量提供了合理的解释，进一步说明了雌核发育抗病草鱼相较于普通草鱼的高免疫机能。

3.2雌核发育抗病草鱼血清溶菌酶活性优于普通草鱼

溶菌酶是一种能水解致病菌中粘多糖的碱性酶，是各种动物极为重要的一类非特异性免疫因子。YADA[15]和YE等[1 6]的研究指出该酶除了具有抗菌、消炎、抗病毒等作用外，还可诱导调节其他免疫因子的合成与分泌，是动物免疫环节中不可或缺的因素。随着草鱼免疫学研究的发展，溶菌酶在草鱼免疫系统中的作用越来越清晰。武焕阳等[17]的研究表明草鱼的溶菌酶是草鱼抵抗病原菌感染的重要非特异性因子之一。Rombout等[18]和关建义等[19]认为，在水产动物血清中，溶菌酶活性的高低是衡量机体免疫状态的重要指标，同时又是衡量养殖环境污染程度的重要指标。因此，草鱼血清溶菌酶活性的测定能较为准确地反应出草鱼抗病性的强弱。本研究结果表明，雌核发育抗病草鱼血清中溶菌酶活性明显高于普通草鱼（P<0.05），说明雌核发育抗病草鱼比普通草鱼能更有效地抵御细菌感染，从而进一步说明了与普通草鱼相比，雌核发育抗病草鱼具有更好的免疫机能。

3.3从生化指标角度显示的雌核发育抗病草鱼抗病力的优越性

草鱼的血清生化指标不仅与生活环境和营养有关，还与性别和健康状态有关。冯建等[20]的研究指出，依据血液指标的变化所指示的生物机体的功能变化，不仅可以诊断鱼病和检测饲养环境，还可以在遗传育种方面提供重要支持。谷草转氨酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、白蛋白和肌酐均是机体抵御病害及反映器官机能的重要免疫因子。本研究通过对雌核发育抗病草鱼与普通草鱼血清中这5种免疫因子的测定比较来探究两者抗病性的差异。实验结果显示，雌核发育抗病草鱼血清中白蛋白、碱性磷酸酶和谷丙转氨酶的含量均显著高于普通草鱼，差异极为显著（P<0.01）。谷草转氨酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶均与肝脏等器官的功能有关，其数值增加能直观地反应出机体的健康状态和抵抗疾病的能力。雌核发育抗病草鱼血清中谷丙转氨酶含量增加，说明氨基酸的转换作用增强，联合脱氨作用更容易进行，即鱼体内氨基酸的氧化代谢强度较大。但增加后的谷丙转氨酶数值是否已达到了肝脏损伤的临界值，尚需作进一步的研究。ZHU等[21]研究发现，活动量多的鱼，体内白蛋白增加。雌核发育抗病草鱼血清中白蛋白含量是普通草鱼的4倍，提示抗病草鱼的生命活力较为旺盛，体质健康。肌酐是肌肉的代谢产物，检测血液中肌酐是了解肾功能的主要方法之一，肾功能衰退，则肌酐含量增加。本研究显示雌核发育抗病草鱼与普通草鱼血清中肌酐含量虽然没有显著差异，但雌核发育抗病草鱼略低于普通草鱼，～定程度上反映了其肾脏良好的功能。本研究结果充分显示了雌核发育抗病草鱼在血清免疫生化因子方面较普通草鱼的明显优势。

以上研究结果显示，雌核发育抗病草鱼在免疫机能上优于普通草鱼。本研究结果为鱼类抗病育种成果评价建立全面、准确、权威的评估体系提供了参考。

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