水稻DREB1基因植物表达载体的构建

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摘要：研究提取低温处理的水稻幼苗总RNA，用DREB1基因特异引物通过RT-PCR扩增出1029 bp的片段。序列分析结果表明，该克隆序列与GenBank上的DREB1基因序列同源性达100%。利用HindⅢ酶切位点将含有35s启动子、OsDREBI和NOS终止子的基因片段正向插入到pZY101载体中，并采用冻融法热击转化到农杆菌EHA101中，为通过遗传转化方法研究DREB1的功能奠定基础。

关键词：水稻DREB1 基因 过表达

干旱、低温、盐害等非生物胁迫严重影响植物的生长发育和产量，转录因子在调节植物生长发育及对环境胁迫的适应性方面起着非常重要的作用。干旱应答元件结合蛋白（dehydration responsive ele-ment binding protein，DREB）类转录因子是植物体内一种非常重要的转录因子，能特异性启动子中的DRE/CRT顺式作用元件，激活下游相关逆境基因的表达，在植物对非生物胁迫的分子反应中起着重要的调控作用。1998年自Liu等首次从拟南芥中克隆到DREB基因，并发现该类基因的过量表达能有效提高转基因植物的抗逆性以来，DREB基因的克隆、功能鉴定及其作用机制等已经成为目前植物抗逆基因工程的研究热点。

研究从低温处理的水稻幼苗中克隆DREB1基因，构建水稻DREB1基因的过表达载体，以期在后期研究中通过农杆菌介导转入大豆基因组中，获得水稻DREB1基因过表达转基因大豆植株，为进一步研究DREBJ的功能和获得有抗逆性的新品种奠定基础。

1材料与方法

1.1供试材料

植物：水稻品种9311幼苗。

载体：pGEM-T Easy质粒，采购自Promega公司；pUC18载体，由华南农业大学农学院张桂权教授实验室馈赠；双元载体pZY101、pZY102由美国密苏里大学张展元教授馈赠。

菌株：大肠杆菌DH5α由华南农业大学农学院张桂权教授实验室惠赠，农杆菌EHA101由美国密苏里大学张展元教授惠赠。

1.2水稻总RNA的提取

参照TRIzol一步法分离总RNA。

①在液氮中研磨100 mg材料，研碎后转入到含1 mL TRIzol试剂的1.5 mL离心管中，充分混匀：

②室温放置5 min；

③每支管中加入0.2 mL新鲜氯仿，剧烈振摇15 s，25℃温育2～3 min；

④≤12，000 rpm，4℃，离心15min；

⑤把上方无色的水相转移到一个新的1.5 mL离心管中，用0.5 mL异丙醇沉淀RNA，室温放置10min；

⑥≤12，000 rpm，4℃，离心10min；

⑦去上清，将RNA沉淀用1 mL 75%乙醇清洗2次，超净台吹干；

⑧将RNA沉淀溶于适量DEPC.ddH20中，通常为50～100 μL，60℃水浴10 min，-70℃保存；

⑨将提取好的RNA样品（0.5～1μg），用1/3倍的TAE缓冲液配置的琼脂糖胶，在300 v电压下电泳5 min，检测RNA提取的质量；

⑩用分光光度计分别检测RNA在260 nm和280 nm处的分光光度值以此来确定RNA的纯度和浓度。同时取1μL RNA样品于1.2%的甲醛变性胶上进行电泳检测。

1.3 RT-PCR

①反转录第1链cDNA的合成

参照RT-PCR试剂盒（Promega）说明书进行。

②PCR合成第2链

取第1链稀释2倍的产物1 μL为模板，按常规PCR程序进行PCR扩增。

根据OsDREBl的cDNA序列设计引物。引物序列如下：

OsDREB1-1：5"CTGATAGCCTCCTTGATTTT3’；

OsDREB1-2：5"AAGACGAAAACCGTAAATG

③将培养物转移至50 mL离心管中，冰浴10min，4℃，4，000 rpm离心10min，收集菌体；

④沉淀用20 mL冰预冷的无菌100 mmol/LCaCl₂重悬，冰浴10min；

⑤4℃，4，000 rpm离心10min，收集菌体；

⑥沉淀再用2 mL 100 mmol/L CaCl₂（含15%的甘油重悬，得到感受态的菌体；每管50μL分装后，可放于-70℃冰箱中保存，备用。

连接产物转化大肠杆菌：

①取感受态细胞一支，加入适量的连接产物，用枪头轻轻吹吸混匀后，冰浴30 min，42℃热激90 s，冰上迅速冷却2 min，加入600 μL LB培养基，37℃，150 rpm温育45min；

②涂布适量的细胞于筛选培养基平板上，超净台上吹干培养基表层液体，37℃倒置平板培养12～16 h，筛选抗性菌落。

1.6重组子的筛选、鉴定和保存

取1 μL质粒溶液，用适当的限制性内切酶做酶切鉴定，酶切体系通常为：1 μL质粒DNA，2 μL10×buffer，0.5 μL限制性内切酶，加ddH20至终体积20 μL。适当的温度（37℃或30℃）

酶切2～4 h之后，用0.8%～1.0%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，分析酶切结果。

取1 μL稀释50～100倍的质粒溶液作为模板，用特异的引物进行PCR鉴定。经鉴定的菌落，在LB液体培养基中活化后，37℃，200 rpm，摇至OD₆₀₀>1.4。取适量的菌液与甘油混匀，通常两者的比例为0.65 mL菌液：0.35 mL 50%的甘油，-70℃保存。

1.7农杆菌EHA101感受态细胞的制备与转化

参照Sambrook等的方法。

①从YEP平板上挑取新活化的农杆菌单菌落，接种于3 mL加有相应抗生素的液体YEP培养基中，28℃，200 rpm过夜培养；

②取2 mL培养物至50 mL液体YEP中，继续培养至OD₆₀₀为1.0左右；

③将培养物冰浴30 min，4℃，5，000 rpm，离心5 min；

④弃去上清，10 mL 0.1 mol/L冷的NaCl悬浮菌体，4℃，5，000 rpm，离心5min；

⑤弃上清，1 mL 20 mmol/L冷的CaCl₂悬浮，分装成100μL/管，液氮中冷冻后-70℃保存。

1.8重组质粒对农杆菌的转化与鉴定

冰上融化感受态细胞，加入5 μL质粒DNA，冰浴30 min，液氮中冷冻1 min，再37℃水浴5min。加入0.5 mL含有相应抗生素的YEP，28℃，200 rpm，振荡培养2～3 d。将转化后的菌液200μL均匀涂于附加相应抗生素的固体YEP培养基上，置于28℃下培养2～3 d。

从转化后的平板挑取单菌落接种至2 mL YEP液体培养基中，28℃振荡培养24 h之后，进行PCR鉴定。

2结果与分析

2.1水稻DREB1基因的克隆

提取低温处理水稻幼苗总RNA反转为cDNA，以cDNA为模板，根据OsDREB1的特异引物扩增获得OsDREB1基因片段（图1）。基因片段与pGEM-TEasy连接经PCR和酶切鉴定后送上海生工测序，测序结果显示克隆片段序列与Gen Bank中的DREBI完全相同，表明实验成功克隆Os-DREB1基因。OsDREBI基因在NCBI上的登录号为AY064403，全长开放阅读框cDNA序列为1029bp（图2），编码281个氨基酸。

2.2水稻DREB 1基因超表达载体的构建

2.2.1 pUC18-pZY102载体改造

在构建载体之前需要对现有载体进行改造，用PstI和SmaI双切pUC 18之后补平末端并环化形成中间载体ApUC18，再用HindⅢ线性化ApUC18载体，用HindⅢ切除pZY102载体中除35S-GUS-NOS以外的其他部分，然后用连接酶将两者连接，改造成符合实验要求的载体ApUC18-pZY102。

2.2.2 ApUC18-pZY102-OsDREB1载体构建

用BamHI和KpnI酶切OsDREB1-TEasy载体，回收基因片段，再与同样用BamHI和KpnI酶切的ApUC18-pZY102质粒按等摩尔浓度进行连接反应。转化大肠杆菌，挑取阳性菌落，摇菌后再抽提质粒DNA，命名为ApUC18.pZY102-Os-DREB 1，-20℃保存备用。

2.2.3 OsDREB1-pZY101超表达载体构建

用HindⅢ酶切ApUC18-pZY102.OsDREB1载体回收35S-OsDREBI.NOS片段，再与用HindI-Ⅱ酶切并去磷酸化的pZY101质粒按等摩尔浓度连接，转化大肠杆菌，通过菌落PCR获得阳性菌落（图3），再抽提质粒DNA进行酶切鉴定（图4），这样就形成了由烟草花叶病毒CAMV35s启动子启动，以NOS终止的OsDREB1-pZY101超表达载体。

2.3农杆菌的转化及鉴定

热击法转化农杆菌EHA101菌株，提取质粒DNA，进行PCR鉴定（图5）。特异地扩增出目的片段，表明重组质粒已经转入农杆菌中。

3讨论与结论

植物生长经常面临干旱、高盐、低温等非生物胁迫，由逆境胁迫导致的作物减产十分严重。DREB类转录因子主要与植物抗逆性相关，在胁迫信号传递过程中起重要作用，它可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因的表达，增强植物的抗逆性，提高稳定性。水稻OsDREBI基因属于DREB转录因子家族，前期研究表明在玉米、大豆、大麦和水稻中异源超表达DREB类转录因子能够提高转基因植株的综合抗性。花椰菜花叶病毒35S启动子是一种组成型强启动子，可以在所有细胞、组织和器官中持续发挥作用，不仅能在双子叶植物中高效启动基因表达，在一些单子叶植物中也能启动基因表达。CaMV35s启动子内部没有我们常用的酶切位点，因此容易克隆和使用，在植物基因工程中得到广泛应用。本研究克隆水稻DREB1基因，采用CaMV35s作为启动子，成功构建了水稻DREB1基因超表达载体，以期为进一步研究DREB1的功能和获得有抗逆性的新品种奠定基础。

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