液体活检在肿瘤监测管理中的应用

摘要：目前临床在诊疗过程中，无活检组织样本的情况下，常规使用液体活检检测肿瘤敏感靶点以寻找敏感靶向药。而最新研究中液体活检计算的肿瘤突变负荷（bTMB）可以对PD-1/L1抑制剂进行疗效预测;同时越来越多的研究发现液体活检可以通过对肿瘤分子负荷进行检测分析，用于肿瘤的预后评估，微小残留病灶監测，以及肿瘤的克隆进化分析，这使得液体活检有望在肿瘤诊疗过程中辅助临床进行更全面的监测管理，本文就此做一综述。

关键词：液体活检;肿瘤;ctDNA;液体监测

中图分类号：R730.43                                 文献标识码：A                                DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.19.010

文章编号：1006-1959（2019）19-0029-03

Application of Liquid Biopsy in Tumor Monitoring and Management

HE Wen-ting1，ZHAI Yun-lan2，ZHANG Hong-liang1

（1.Department of tumor，Subject Two，Xinjiang Uygur Autonomous Region Hospital of Traditional Chinese Medicine，

Urumqi 830000，Xinjiang，China;

2.Beijing Jiyinjia Technology Co.，Ltd.，Beijing 102200，China）

Abstract：At present， in the clinical diagnosis and treatment process， without biopsy tissue samples， routine use of liquid biopsy to detect tumor-sensitive targets to find sensitive targeted drugs. The tumor mutation load （bTMB） calculated by liquid biopsy in the latest study can predict the efficacy of PD-1/L1 inhibitors. At the same time， more and more studies have found that liquid biopsy can be used for tumor analysis by analyzing tumor molecular load. Prognostic assessment， micro-residual lesion monitoring， and clonal evolution analysis of tumors make liquid biopsy promising for more comprehensive monitoring and management during tumor diagnosis and treatment. This article reviews this issue.

Key words：Liquid biopsy;Tumor;ctDNA;Fluid monitoring

2012年，研究者首次发现Nivo单抗可使非小细胞肺癌（NSCLC）患者从中获益，目前免疫治疗已经成为肿瘤治疗最具希望的治疗方式，肿瘤成为慢性病或许成为可能[1]。受肿瘤自身的特点和目前的临床诊疗限制，70%的肺癌患者在初诊之时已属晚期状态，无法获得足够的组织用于检测[2]。在治疗过程中，由于肿瘤的时空异质性，需要进行不同部位、不同治疗节点的多次基因信息检测，在临床上需进行更加精准的治疗。目前临床通过影像学和/或肿标进行肿瘤监测/疗效评价，但存在灵敏度和特异性不足的问题，而且单从影像学和肿标的疗评结果只能判断病情进展，却无法得知疾病进展的真正原因。循环游离DNA（cfDNA）是血液中细胞成分之外的小片段DNA，由细胞凋亡或坏死后释放入血，肿瘤所释放的DNA称为循环肿瘤DNA（ctDNA），是cfDNA的一部分，ctDNA的含量占比与肿瘤负荷相关，被形象的比喻为“分子听诊器”，因此基于外周血的液体活检具有检测标本易获取的独特优势，或许能够辅助临床获取一些分子层面的疾病进展原因。除了代替组织样本检测和评效之外，液体活检ctDNA在肿瘤早筛、疾病分型、治疗决策、疗效监测、肿瘤异质性分析、耐药分析等方面都有研究应用探索[3]。目前液体活检肿瘤检测中的应用包括靶点检测，预测靶向药物疗效，计算肿瘤突变负荷（TMB），预测PD-1/L1抑制剂疗效，监测分子肿瘤负荷，克隆进化分析等，本文对液体活检检测肿瘤的应用进行综述。

1靶点检测

目前针对靶点检测，有多个基因检测的平台并有多种方法可以选择，且各有优势。DHPLC法对晚期NSCLC患者行EGFR基因突变检测，灵敏度3%，该检测方法获得欧盟认证;ARMS检测因检测灵敏度高、仪器设备要求低、操作流程及数据分析简单，且CSCO肺癌诊疗指南作为Ⅰ类证据推荐采用ARMS方法行EGFR基因突变检测，2014年以后将检测技术更换为灵敏度相对高的ARMS法;微滴数字PCR技术，其灵敏度相对更高，目前仅用于科研;二代测序技术可实现多基因平行检测，检测灵敏度由测序深度决定，既往文献报道当测序深度达1×104时，其EGFR基因突变检测灵敏度0.2%[4]。目前，常用的平台为CSCO指南推荐的ARMS检测或数字PCR检测，特别是随着NGS检测技术的兴起和发展，NCCN、CSCO指南建议临床也选择NGS panel检测，其血浆检测检出限低，组织和血浆检测一致性高，一次检测多基因以筛选更多获益患者。

Wang Z等[5]的研究提示血浆ctDNA检测可精准指导靶向治疗，使用多基因NGS检测发现，除了EGFR突变，同时伴随存在驱动或抑癌基因突变检出，会导致TKI获益时间缩短，提示治疗疗效不佳。在治疗过程中，EGFR敏感突变的存在与否也可以提示治疗的预后。有研究对比了4种血浆ctDNA检测T790M的平台，以cobas组织检测作为参照，NGS血浆T790M检测显示出较高的敏感性和一致性[6，7]。NGS检测指导精准治疗，疗效分析结果显示，ctDNA液体活检在靶点检测、预测药物疗效方面具有临床指导价值。

因此液体活检技术的应用里，敏感靶点的检测已经成为临床常用的技术，同时NGS检测在所有液态活检技术里具有更多的临床意义，可以做多基因panel检测，在寻找敏感靶点的同时，排查耐药突变以及检测伴随突变，对靶向药的疗效可以在分子层面做出一定的疗效预估。

2计算肿瘤突变负荷

多个癌种的综合研究发现TMB跟免疫疗效成正比，TMB一般以肿瘤非同义突变总数量或每1Mb碱基的突变数量来表示。虽然，从突变到产生新抗原的每一步都有较大折损，但理论上：TMB越高，最后能够被T细胞识别的新抗原产生也越多，对PD-1/PD-L1抑制剂可能更敏感[8，9]。对于TMB<1 Mb的肿瘤患者几乎不可能产生新抗原，对PD-1/PD-L1抑制剂不敏感[10]。基于肿瘤组织的肿瘤突变负荷（TMB）已被论证与恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、尿路上皮癌等多个实体瘤的免疫检查点抑制剂（ICB）单药疗效正相关。然而，在临床上多数患者并没有足量的肿瘤组织标本做TMB检测。此基于血液样本检测TMB（bTMB），并以此进行疗效预测，有待于展开进一步的探索研究。目前虽然国际上对TMB cut-off值的标准还未确定[11]，但是研究者们已经根据各自的NGS检测芯片以及检测方法得出了多个cut-off值，而这些cut-off值无论是10、16还是20，都可以看到显著的中位生存期（PFS）和总生存期（OS）的获益。同时因活检组织经常难以获得，目前也在使用液体活检获得TMB值（bTMB），从研究结果可以看到bTMB≥16且PD-L1表达>50%的患者从Atezolizumab的治疗中获益最多。在bTMB≥16的人群中，PFS HR为0.57（95%CI： 0.33～0.99），实验组与对照组中位PFS分别为4.2个月和2.9个月，HR为0.57（95%CI：0.33～0.99），中位OS分别为13.0个月和7.4个月。由于bTMB≥16组观察到了更优的PFS获益，最终选择了16为cut-off值。进一步扩大患者人群验证也得到同样的结论。在bTMB≥16人群中，研究显示PFS和OS获益显著，PFS HR为0.65（95%CI：0.47～0.92），OS HR为0.64（95%CI：0.44～0.92），进一步确定了16是bTMB预测Atezolizumab疗效合适的cut-off值[12]。

在2019年NCCN指南中建议进行TMB检测，筛选免疫治疗获益患者。但是，其评估标准尚未达成共识。Büttner R等[13]总结了目标区域检测计算TMB值需要参考的一些因素，首先是样本类型，建议优先选用组织样本;检测基因的目标区域应>0.8 Mb（最好>1 Mb），以确保TMB值的可靠性;对于目标区域检测得到的TMB值，另外还需要与WES检测得到的TMB结果做一致性分析;但是cut-off值目前尚无标准，需要与免疫抑制剂临床疗效数据关联进行确定。

3分子肿瘤负荷监测

已有研究表明，ctDNA水平与肿瘤分期、肿瘤体积大小、转移灶个数及治疗都有关，可以反映肿瘤负荷，即“分子CT”[14]。在肝癌的一项研究中发现，肿瘤大小与ctDNA和肿标相比，相关性更强。在肺癌中发现，ctDNA可以提示肿瘤预后，高ctDNA水平与预后差相关，转移性结直肠癌中也是如此，并且比肿标有更高的灵敏性[15，16]。

Abbosh C等[15]的研究选择40例肺癌患者和54名健康成人的255个样本进行研究，在94%经历复发的可评估患者中，ctDNA在第一次治疗后血液样本中被检测到，表明ctDNA可評估术后微小残留病灶（MRD）。治疗后ctDNA检测，在72%的患者中进行放射学检查，中位数为5.2个月，53%的患者携带与酪氨酸激酶抑制剂或免疫检查点阻滞有利反应相关的ctDNA突变谱，可从靶向治疗和免疫治疗中获益。活检液体可以准确地检测肺癌患者的ctDNA MRD，同时为患者提供个性化治疗参考。另有研究显示，女性早期乳腺癌患者在新辅助治疗后手术，监测术后ctDNA的有无评估肿瘤复发风险，发现术后ctDNA与肿瘤复发风险高度相关，提示术后ctDNA可以监测肿瘤复发风险。Raja R 等[17]的研究显示，93%肺癌患者在监测过程中出现ctDNA阳性（2个以上SNV）其中3例患者，辅助化疗前后，血浆检出SNV数目上升，且均在术后一年出现了复发，提示ctDNA 分析能够反映辅助化疗耐药，且与肿瘤疗效和复发相关。患者术前50天进行PET检测，未发现脑部病灶;术后血浆中有ctDNA检出;术后54天，临床确诊脑部转移，无其他病灶。该结果提示ctDNA较影像学更灵敏，可能更早提示复发。使用durvalumab治疗的肺癌患者研究显示[18，19]，用药后6周ctDNA水平降低的患者肿瘤体积变小、治疗获益时间长，提示ctDNA水平与免疫治疗疗效相关，ctDNA可监测免疫治疗效果。

4克隆进化分析

肿瘤的发生、发展往往伴随着新突变的产生和原有突变的积累。从进化角度上来看，越早发生的突变，在系统进化树中的位置就越靠近主干，相反，越晚发生的突变则位于系统进化树的分支。通常情况下，组织活检，检出的是区域性的亚克隆群体。而血浆ctDNA中则涵盖了肿瘤组织中不同的克隆DNA片段，从而可以反映不同时间节点肿瘤克隆组成的动态变化[20]。因此，血浆ctDNA检测，可用于研究肿瘤克隆进化和耐药克隆的发生、发展。

在不同癌種的不同治疗阶段过程中，可能出现癌种特异和阶段特异的驱动突变，但不同癌种间也存在共同的驱动事件[21]。Wang Z等[5]研究显示，吉非替尼治疗开始后，第8周EGFR突变消失的患者预后好，说明动态监测EGFR突变有助于预测预后;血浆出现获得性T790M 突变的中位时间为7.6月（95%CI：6.0～10.0）。从T790M阳性至疾病进展的中位时间为2.0月（95%CI：2.0～4.9）。关于临床该何时更改治疗方案，已有Remon J等[22]的研究对比了吉非替尼治疗EGFR阳性患者分别在影像学和ctDNA提示PD时，更换治疗方案比较其获益时间，目前研究还在进行中，结果尚不清楚。

综上所述，液体活检目前主要应用在于：靶点检测、靶向药物疗效预测、TMB、预测PD-1/L1抑制剂疗效、评估肿瘤预后、微小残留病灶MRD和复发监测分子肿瘤负荷、克隆进化分析等方面。基于目前临床通过影像学、肿标进行肿瘤监测、疗效评价存在灵敏度和特异性不足的问题，液体活检通过其独特优势，在肿瘤的全病程管理中起到协助临床的作用，帮助临床进行精准诊疗。

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