快速改良法NAP染色法在新生儿急性呼吸窘迫综合征诊断及病情评估中的价值

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[摘要] 目的 观察快速改良法中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）染色在新生儿急性呼吸窘迫综合征诊断及病情评估中的价值。 方法 选取2014年2月～2015年4月河北省沧州中西医结合医院儿科诊治的57例新生儿急性呼吸窘迫综合征患儿为研究对象，设为观察组。根据观察组患儿的严重程度分为轻、中、重度三组。选择同期的健康新生儿55例作为对照组。采用快速改良NAP染色方法，比较各组新生儿NAP阳性率和阳性积分的差异。 结果 观察组患儿NAP阳性率及NAP积分均明显高于对照组[（55.7±15.8）%比（24.3±11.2）%；（147.8±81.1）比（42.5±15.3）分]，差异有统计学意义（P < 0.05）；观察组患儿中，中度组与重度组NAP阳性率及NAP积分均明显高于轻度组[（48.2±12.6）%、（67.1±18.6）%比（37.4±11.3）%；（120.4±50.8）、（181.6±93.2）比（70.3±22.4）分]，差异有统计学意义（P < 0.05）；重度组NAP阳性率及NAP积分明显高于中度组[（67.1±18.6）%比（48.2±12.6）%；（181.6±93.2）比（120.4±50.8）分]，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 快速改良NAP染色有助于新生儿急性呼吸窘迫综合征的诊断及其严重程度的判断。

[关键词] 中性粒细胞碱性磷酸酶；快速改良；新生儿急性呼吸窘迫综合征

[中图分类号] R563.8 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）01（a）-0137-04

Clinical significance of rapid improvement of NAP staining in diagnosis and evaluation of neonatal acute respiratory distress syndrome

ZHANG Jinbiao1 LIU Yuxin1 ZHANG Yuzhi2 HU Haitao1 LIU Gang3 WANG Feng4 LI Juan1

1.Department of Laboratory Diagnostics， Cangzhou Hospital of Traditional Chinese and Western Medicine， Hebei Province， Cangzhou 061001， China； 2.Department of Clinical Laboratory， Cangzhou People"s Hospital， Hebei Province， Cangzhou 061001， China； 3.Department of Neurosurgery， Cangzhou Hospital of Traditional Chinese and Western Medicine， Hebei Province， Cangzhou 061001， China； 4.Department of Orthopaedics， Cangzhou Hospital of Traditional Chinese and Western Medicine， Hebei Province， Cangzhou 061001， China

[Abstract] Objective To observe the diagnostic value and the condition assessment value of the improved method neutrophil alkaline phosphatase （NAP） staining in neonatal acute respiratory distress syndrome. Methods From February 2014 to April 2015， 57 cases of neonatal with acute respiratory distress syndrome treated in Pediatrics Department of Cangzhou Hospital of Traditional Chinese and Western Medicine were selected as observation group. They were divided into mild， moderate and severe three groups depending on the severty of illness. 55 cases of healthy newborns in the same period were chosen as the control group. Rapid improvement of NAP staining method was used， the differences in neonatal NAP positive rate and positive score were compared between the two groups. Results The NAP positive rate and NAP score of the observation group were significantly higher than those of the control group [（55.7±15.8）% vs （24.3±11.2）%； （147.8±81.1） vs （42.5±15.3） points]， the differences were statistically significant （P < 0.05）. In the observation group， the NAP positive rate and NAP score of the moderate group and severe group were significantly higher than those of the mild group [（48.2±12.6）%， （67.1±18.6）% vs （37.4±11.3）%； （120.4±50.8）， （181.6±93.2） vs （70.3±22.4） points]， the differences were statistically significant （P < 0.05）； the NAP positive rate and NAP score of the severe group were significantly higher than those of the moderate group [（67.1±18.6）% vs （48.2±12.6）%； （181.6±93.2） vs （120.4±50.8） points]， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The rapid improvement of NAP staining can help determine the diagnosis and severity of neonatal acute respiratory distress syndrome.

[Key words] Neutrophil alkaline phosphatase； Rapid improvement； Neonatal acute respiratory distress syndrome

中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）是存在于成熟中性粒细胞胞浆中的一种酶，中性粒细胞数量的检测在临床已常规化，并有其重要的临床鉴别诊断价值。NAP的检测在血液病鉴别诊断中应用广泛，主要用来鉴别慢性粒细胞白血病和类白血病反应性疾病；鉴别再生障碍性贫血和阵发性睡眠性血红蛋白尿；以及急性白血病的分型等。NAP在鉴别细菌感染和病毒感染方面价值斐然，但由于操作复杂，费时费力，不容易被实验室接受，所以利用经典的NAP染色方法为临床诊治感染性疾病带来很大困难，导致目前NAP不能顺利地应用于感染性疾病。超敏C反应蛋白（hs-CRP）和血细胞比容（HCT）在鉴别诊断细菌感染中的价值已备受临床认可，也有较多研究阐明了其在炎性感染疾病中的诊断意义，并广泛应用到实验室中。NAP除了在血液病、细菌感染等疾病诊断中应用外，其在其他疾病中也有一定的诊断价值，本文研究对象为新生儿急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）患儿。

ARDS是新生儿尤其是早产儿常见的危重疾病，该病的特点是起病急，发展迅速，病死率较高。有研究表示，肺组织炎症的发生和发展在ARDS的进展过程中起着重要作用[1-2]。其实，ARDS是患者肺部损伤最为严重的一个阶段，一直以来，都认为ARDS只限于成年人，但一些早产儿在肺部发育不良时，或肺部表面活性物质缺乏或不足时亦可出现ARDS，近几年，新生儿ARDS发病率逐渐上升，引起了人们的高度重视，新生儿主要由于肺脏发育不全，肺泡表面活性较小，肺部血管丰富，一旦缺氧便会出现一些临床疾病症状。NAP主要存在于成熟的中性粒细胞胞浆内，当机体处于感染、发热等应激状态时，NAP活性增加[3]。本研究通过分析不同严重程度的ARDS患儿NAP阳性率及阳性积分情况，探讨NAP在新生儿ARDS中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年2月～2015年4月在河北省沧州中西医结合医院（以下简称“我院”）就诊的57例新生儿ARDS患儿为研究对象，设为观察组，其中男31例，女26例。根据观察组患儿的严重程度分为轻、中、重度三组。其中，轻度组23例（男12例，女11例），中度组18例（男10例，女8例），重度组16例（男9例，女7例），三组患儿性别比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。选择同期的健康新生儿55例作为对照组，其中，男30例，女25例。观察组与对照组患儿性别比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。本研究通过医院论文委员会研讨，患者及家属签订知情同意书，符合医学伦理要求。ARDS及病情严重程度[4]参照柏林ARDS的诊断及病情严重程度的诊断标准。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 采用一次性采血针，刺左手无名指手指腹内侧，弃去第1滴血，制作新鲜外周血涂片各2张，2 h内完成血涂片制作，并且等待血涂片自然风干后，染色，阅片。

1.2.2 试剂与仪器 主要试剂：10%甲醛甲醇溶液、2氨基-2甲基-1，3-丙二醇、萘酚AS-BI磷酸盐、坚牢兰RR盐、N-N二甲基甲酰胺、苏木精复染液。主要器材：一次性玻片（沧州康利阳光公司）、日本奥林帕斯显微镜（厂家：日本，型号：OLYMPUS X41）、恒温箱（厂家：北京市福意联电器有限公司，型号：FYL-YS）。

1.3 NAP快速染色方法

1.3.1 试剂的配制[5] ①固定液（10%甲醛甲醇溶液）：取10 mL甲醛加入90 mL甲醇中充分混匀，冷藏备用；②缓冲液：取2.1 g 2氨基-2甲基-1，3-丙二醇溶于90 mL蒸馏水，再加0.1 mol/L盐酸10 mL，混匀，加蒸馏水至400 mL，4～8℃储存。③底物储存液：萘酚AS-BI磷酸盐20 mg和坚牢兰RR盐200 mg，先后溶于10 mL的N-N二甲基甲酰胺溶液中，混匀，然后以20 μL为单位分装在规格为0.5 mL的离心管内，冰箱冷冻保存（有效期约1年），可分装500个，理论上检验500个标本。④作用液：1 mL“②”+20 μL“③”，现用现配。⑤复染液：1 g/L的苏木精复染液。

1.3.2 操作步骤 ①固定：取小吸管吸取固定液滴加在涂片血膜上，覆盖血膜即可，计时10 s左右，水冲洗晾干。②染色：取1 mL缓冲液于塑料试管中，加作用液20 μL混匀，滴加在血膜上，置于37℃恒温箱温育染色15 min，水冲洗晾干；③复染：复染液5 min，水冲洗晾干。

1.3.3 镜检方法 油镜下计数100个中性粒细胞，记录阳性率和积分值。阳性物质为浓蓝色，呈颗粒状。阳性率为计数100个成熟中性粒细胞中阳性细胞/100×100%，用“%”表示。阳性细胞按阳性程度可分为6级：0级：（-）无阳性颗粒；1级：（1+）少量阳性颗粒，少于5个；2级：（2+）中等量阳性颗粒，5～30个可以清楚辨别；3级：（3+）多量阳性颗粒，30个以上呈大小不同均匀分布；4级：（4+）大量阳性颗粒，30个以上大小不同分布不均匀，但颗粒之间可以清楚辨别；5级：（5+）充满中性粒细胞胞浆，且颗粒之间不可清楚辨别，呈团块状。阳性积分计算标准：按照每个阳性细胞的阳性级别计分，0级0分，1级1分，2级2分，3级3分，4级4分，5级5分，然后将计数的100个中性粒细胞中阳性细胞的分数累加，即得到阳性积分值。公式：阳性积分=0级个数×0+1级个数×1+2级个数×2+3级个数×3+4级个数×4+5级个数×5。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察组与对照组NAP染色情况比较

观察组患儿NAP阳性率及NAP积分均明显高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

表1 观察组与对照组NAP染色情况比较（x±s）

注：NAP：中性粒细胞碱性磷酸酶

2.2 观察组患儿不同病情严重程度组NAP染色情况比较

观察组患儿中，中度组与重度组NAP阳性率及NAP积分均明显高于轻度组，差异有统计学意义（P < 0.05）；重度组NAP阳性率及NAP积分明显高于中度组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

表2 观察组患儿不同病情严重程度组NAP染色情况比较（x±s）

注：与轻度组比较，*P < 0.05；与中度组比较，#P < 0.05；NAP：中性粒细胞碱性磷酸酶

3 讨论

NAP是存在于成熟中性粒细胞胞浆中的一种酶，中性粒细胞数量的检测在临床已常规化，并有其重要的临床鉴别诊断价值。NAP的检测在血液病鉴别诊断中应用广泛，主要用于疾病鉴别[6-11]，这种观点已报道较多，并且已经成熟应用于临床血液病诊断及鉴别诊断中。NAP在鉴别细菌感染和病毒感染方面价值斐然，其在细菌性感染疾病中的应用方面的相关报道[12-15]也很多，但实际临床实验室应用较少，关于更多的非感染性疾病研究也较少。本文研究了新生儿ARDS的NAP水平变化，试图阐明其应用价值，同时，基于染色方法的改良研究，目的在于将染色步骤简化，降低试剂成本，减少实验影响因素，也取得了很大进步，并取得了良好的预期效果。

新生儿ARDS也称肺透明膜病或特发性呼吸窘迫综合征[16-17]，可因严重感染、创伤、休克等多种原因导致肺泡表面活性物质缺乏，肺泡进行性萎陷引起，是新生儿特别是早产儿常见的一种呼吸系统疾病，患儿常常在出生不久后就出现进行性加重的呼吸窘迫和呼吸衰竭[18]。ARDS的发生机制目前还不是十分明确，有研究发现，机体的炎性反应与ARDS的发生发展密切相关，患者体内炎症介质水平往往发生显著的变化[19]。新生儿ARDS常表现为白细胞总数及中性粒细胞绝对值明显增高，一是因为新生儿的白细胞值生理性增高，二是因为长期处于呼吸窘迫状态下，机体的应急状态导致新生儿白细胞数量增高，这时有可能不存在感染。NAP主要存在于成熟中性粒细胞胞浆内，当机体处于感染状态时，NAP活性增高。本研究中观察组患儿NAP阳性率及积分均明显高于对照组，说明ARDS发生时，NAP活性增高；且增高幅度与病情的严重程度存在着一定的关联，其中，中度组与重度组NAP阳性率及积分均明显高于轻度组（P < 0.05），重度组NAP阳性率及积分明显高于中度组（P < 0.05），说明患儿病情越严重，NAP活性越高。关于NAP在新生儿ARDS方面的研究较少，章希文等[20]研究了NAP在新生儿肺炎中的诊断价值，和本文研究结果一致。目前大部分文献为ARDS治疗方法以及发病因素方面的研究，一些检验指标不但能够对临床儿科疾病有一定的诊断价值，在病情评估以及判断预后中也会起到重要的价值[21-27]。本研究阐明新生儿呼吸系统疾病引发NAP百分率及积分的明显增高，提示NAP在新生儿ARDS中有一定的诊断价值。

综上所述，ARDS发生时NAP活性增高，且病情越严重增高幅度越明显，故NAP染色有助于新生儿ARDS的诊断及其严重程度的判断。

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（收稿日期：2015-09-13 本文编辑：程 铭）

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