浅谈制作细菌革兰染色标本的影响因素

摘要：革兰染色在医学微生物学实验教学中占有很重要的比重，结合实践教学经验，提出一些教学体会。在提高教学效率，改进教学方法上具有借鉴作用。

关键词：医学微生物学；实验教学；革兰染色

【中图分类号】R446.5

基金项目：国家"十二五"重大传染病专项课题基金资助项目（2012ZX10003008-007）

革兰染色法（Gram stain）是微生物细菌学中最经典、最常用的鉴别染色法之一，是1884年由丹麦医师Christain Gram创立，染色将细菌分为革兰阳性菌和革兰阴性菌两大类，在细菌学的形态鉴定、分类和用药选择等方面发挥了重要作用。

革兰染色法一般包括涂抹标本的制备和革兰染色两个方面[1]，细分为涂片、干燥、固定、染色、镜检五个步骤，我们把涂片、干燥、固定、染色统称为涂抹标本的制备。具体操作方法是：先选取洁净无油脂的载玻片一张，用红蓝铅笔在背面划分成两个区，反面标记A、B字样，用接种环挑取生理盐水1-2环分别至干净的玻片每个区的中央，用来稀释所要鉴定的细菌，盐水不宜过多，以便后面的干燥，再将接种环烧灼灭菌，待冷却后，再用接种环挑取要鉴定的细菌少许，均匀涂在生理盐水中，致成均匀

混浊的菌液，待自然干燥后，玻片背面过火焰3次火焰固定；固

定过程中，可用手背感受玻片的温度，以玻片触及手背皮肤热而不烫为宜。细菌加热过程中不宜过热，目的是杀死细菌，使其蛋白质凝固，固定于玻片上，以免后面染色和水洗时被冲掉。现在，涂抹标本就算完成了。我们接下来看下染色步骤。

先用结晶紫染1分钟，然后自来水对着玻片背面冲洗；目的是为了不让水流直接冲在菌体的表面，以免把细菌冲洗掉。加碘液覆盖涂面染1分钟；水洗，用吸水纸轻轻覆盖拨片上面的水渍吸去水分；加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分；复红染色液（稀）染30秒后，自来水冲洗。然后干燥，镜检。染色的结果为革兰阳性菌呈蓝紫色，革兰阴性菌呈红色。这样，一个完整的革兰染色步骤就完成了。但是我们经常在实验课的教学过程中时常发现同学染出的结果不一致，出现了各种不同的结果。通过近几年的实验课教学实践，我们现在做一简要的分析。

1.挑取细菌过多涂片的时候细菌不宜过多，挑的太多，细菌没办法区分开，在脱色的时候就不能将第一步染上的结晶紫的颜色脱去，可能导致假阳性的出现。

2.严格控制脱色时间革兰阳性菌透性小，不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色；如果延长脱色时间，或者缩短脱色时间，都会导致错误，一般以流出的乙醇刚刚不出现紫色为准。

3.菌龄大小细菌的菌龄对革兰染色的结果也有很大的影响，一般16-24小时的E.coli可以得到正确的结果，超过32小时，会出现阴性结果。

4.染液的配置染液一定要新鲜配置。比如碘液，它的作用是增加染料与被染物的亲和力，如果碘液放置时间过长，就很容易被脱色，使本来是革兰阳性菌而染成的革兰阴性菌。结晶紫一定要新鲜配置，放置时间过久会导致颗粒的形成，染色的时候会导致细菌大颗粒的出现，镜下会出现正方形，或长方形的规则的图形，不利于实验结果的观察。脱色酒精的浓度一般为95%，在此浓度下的革兰阳性菌染上的结晶紫不易被脱去，保留紫色，革兰阴性菌染上的结晶紫容易被脱去，最后呈红色。但是当酒精的浓度达到75%，染色结果就会受到影响。

综上所述，革兰染色看起来步骤很简单，但是想要染出一张很漂亮的片子的确不是那么简单，我们一定要严格遵守"紫碘酒红、一一半半"的规则，排除培养基的组成，染色液中的电介质含量和PH、温度等带来细菌染色的影响，控制好菌龄大小、细菌的多少、染色时间、脱色时间等条件[2]，方可保证革兰染色结果的准确性和科学性。在课堂上，我们一定要把这些方面做为重点来讲，使同学从一开始接触微生物学实验就能养成良好的学习态度，分析问题解决问题的能力，以及严格按照操作规程来完成实验的良好实验素质。

参考文献：

[1] 黄静芳.革兰染色影响因素的探讨[J].实用医技杂志，2006，18：3312-3313.

[2] 蒋宏雁.革兰染色实验结果影响因素及考核标准[J].教育研究与实践，2010，6（2）：46-47

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