PCR检测细菌16,s,rRNA基因在临床感染性疾病诊断中的应用

【摘要】 目的 建立检测临床常见细菌16 s rRNA基因的PCR方法。方法 分析细菌16 s rRNA基因保守区，设计通用引物对7种常见细菌16 s rRNA基因进行PCR扩增；并用该方法检测临床血液标本中的16 s rRNA基因表达，与传统培养方法结果进行比较。结果 7种标准菌株均出现特异阳性条带；感染性疾病血液标本16 s rRNA基因阳性表达。 结论 16 s rRNA基因PCR法可用于快速检测临床细菌感染。

【关键词】 聚合酶链反应；细菌；感染；16 s rRNA基因

快速、准确检测出机体内存在的病原菌是临床诊断细菌性感染疾病的重要指标，对疾病的及时、有效治疗具有重大意义。传统的检测方法主要使用常规细菌培养，一般所需时间长，且阳性率不高，因此严重影响了疾病的诊治。应用聚合酶链反应(PCR)法检测细菌感染，具有快速、准确和特异的优点，利于对疾病的快速诊断和及时治疗。本研究建立了细菌16 s rRNA基因的PCR检测方法，旨在提高感染性疾病的检出率，以适应现代临床的需要。

1 材料与方法

1.1 材料 7种标准菌株(大肠埃希菌、产气肠杆菌、枯草芽孢杆菌、变形杆菌、伤寒沙门菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌)由本课题组教研室保存；临床血液标本40例，包括检查确诊的感染性病患血液标本30例与健康者血液标本10例。Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA marker等均购自大连宝生物公司，引物由上海生工公司合成。ASTEC PCR扩增仪(PC-818)，SYNGENE凝胶成像系统(G:BOX)，Eppendorf高速离心机(5415R)。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 采用细菌16 s rRNA基因高保守区设计通用引物，上游引物F: 5-AACTGGAGGAAGGTGGGGAT-3，下游引物R: 5-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3，扩增产物长度为 371 bp。

1.2.2 16 s rRNA基因的获取 挑取单个菌落，加入50 μl抽提裂解液，100℃煮沸10 min，12000 r pm离心 5 min，取上清作为PCR扩增模板；抗凝血液标本以 500 rpm离心 5 min，取血浆50 μl，加入50 μl抽提裂解液，处理步骤同上。

1.2.3 PCR扩增 将标准菌株进行PCR扩增建立检测体系，PCR体系如下：模板2 μl；上下游引物各1 μl；10×Taq buffer(Mg2+ plus)5 μl；dNTPs Mix (10 mmol/L)1 μl；Taq酶(5 U/ μl) 0.5 μl；ddH2O 39.5 μl；反应体系总量为50 μl。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，30个循环；最后于72℃延伸5 min。以同样PCR体系条件扩增检测临床血液标本，将标准菌株作为阳性对照，并与传统培养方法结果进行对比。

2 结果

2.1 标准菌株16 s rRNA基因扩增结果 取5 μl PCR扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，以DNA marker DL2000作标准分子量，用凝胶成像系统观察电泳结果，见图1。PCR扩增后各菌株均在370 bp附近出现特异的目的片段，与预计的片段大小吻合。

2.2 临床血液标本16 s rRNA基因扩增结果 血液标本PCR扩增结果见图2。临床确诊的细菌感染病患血液标本均出现阳性片段，扩增的条带与阳性对照标准菌株(大肠埃希菌)的条带片段大小一致；而健康者血液标本与ddH2O的阴性对照结果未出现特异性条带。

2.3 PCR法与传统培养法检测结果对比 对40例临床血液标本分别进行细菌学培养与PCR检测，其中10例健康者血液标本经两种方法检测均为阴性。30例确诊感染的病患标本经培养检测14例大肠杆菌阳性、12例金黄葡萄球菌阳性、4例阴性，阳性检出率86.7%；培养法检出的26例阳性标本经PCR检测全部为阳性，另有2例培养呈阴性的标本经PCR检测后也呈阳性，阳性检出率达93.3%。虽两者比较未显示统计学显著性差异(P>0.05)，仍表明了PCR法的检出率有高于传统培养法的趋势。

图1

图2

图1 (左) 7种标准菌株16 s rRNA基因片段PCR扩增结果 M:DL2000、1:大肠埃希菌、2:产气肠杆菌、3:枯草芽孢杆菌、4:变形杆菌、5:伤寒沙门菌、6:流感嗜血杆菌、7:金黄色葡萄球菌、8:阴性对照(ddH2O)

图2 (右)临床血液标本16 s rRNA基因片段PCR扩增结果 M:DL2000、-:阴性对照(ddH2O)、+:阳性对照(大肠埃希菌)、1~4:感染性病患血液标本、5:健康者血液标本

3 讨论

有关感染疾病的诊断问题是当前临床研究中的重点，引起感染的病原菌种类繁多，如何快速获知为何种病原体感染，是临床实验室检验迫切需要解决的问题。一些致病菌的培养周期过长、分离技术复杂以及使用抗生素治疗等都会导致细菌培养检测面临困难^［1］，并且对于大量使用过抗生素的临床标本，传统方法更不实用。随着现代分子生物学技术的发展，以细菌16 s rRNA基因序列为基础建立的PCR方法能够快速、准确地检测临床标本中病原菌的感染。此种方法可早期判断细菌感染的存在^［2］，并通过对扩增产物的进一步分析可对病原菌的种属作出鉴定，因而弥补了上述检测方法的不足，是感染性疾病诊断的一个重要突破口。

细菌的16 s rRNA基因序列具有高度保守性, 被称为细菌的“分子化石”^［3］。本研究分析细菌16 s rRNA 基因保守区并设计通用引物，通过PCR方法扩增各种细菌的16 s rRNA基因片段，370bp处获得特异性条带。对于正常情况下无菌的组织和体液标本(如血液、脑脊液等)，只要检测出16 s rRNA 基因片段的特异性表达，即确定有细菌感染。此种方法受抗生素影响小，无需在用药前抽血^［4］，整个PCR扩增仅4~6 h即可完成，完全满足临床快速诊断的要求。因此与传统的感染性疾病诊断方法相比，具有高效、准确、特异性强的优点，可诊断早期的细菌感染，为治疗提供宝贵时机。

本研究对PCR快速检测临床感染疾病的体系建立进行了初步探讨。因16 s rRNA基因只存在于原核生物，不存在于病毒、真菌等非原核生物体内^［5］，故此方法只对于细菌性感染疾病的初步检测具有临床指导意义；而且对细菌种属的鉴定还需进一步分析，如序列测定等。另外，PCR操作过程中易因污染导致假阳性结果^［6］，因此实验中应严格规范无菌操作，并设立阴性对照，由此提高检测结果的正确性和可靠性。

参 考 文 献

［1］ Su WQ, Ji YC, Jiang Y. Application of the 16 s rRNA gene assay in clinical bacterial identification. World Journal of Infection, 2005, 5 (1): 79-81.

［2］ Zhang F, Song L. Progress about the detection of 16 s rRNA gene in the diagnosis of neonatal septicemia. Medical Recapitula, 2006, 12(17):1035-1037.

［3］ Hoffmann M, Brown EW, Feng PC, et al. PCR-based method for targeting 16 s-23 s rRNA intergenic spacerregions among Vibrio species. BMC Microbiology, 2010, 10: 90.

［4］ Jordan JA, Durso MB. Comparison of 16 s rRNA gene PCR and BACTEC 9240 for detection of neonatal bacteremia. Clin Microbiol, 2000, 38(7): 2574-2578.

［5］ Li X, Gao Q. The application of t he 16 s rRNA gene assay in clinical microbiology. Journal of Microbes and Infection, 2006, 1(3): 184-186.

［6］ Carroll NM, Jaeger EE, Choudhury S, et al. Detection of and Discrimination between Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria in Intraocular Samples by Using Nested PCR. Clin Microbiol, 2000, 38(5): 1753-1757.

注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文

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