成人血源性内皮祖细胞转分化为有功能活性的心肌细胞

方案通过广东医学院附属医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 人外周血来源的内皮祖细胞以及大鼠心肌细胞的分离、培养 取1～2日龄SD大鼠分离得到新生心室肌细胞，差速贴壁法分离出心肌细胞，此过程中加入2 μg/ml丝裂霉素C。按1.2×105/cm2密度接种于明胶包被的培养皿中。将一部分细胞接种于玻片上便于免疫细胞化学检查。从人外周血中分离出EPCs，培养3 d后，然后用荧光示踪剂Dil-acLDL标记。将心肌细胞与EPCs按4∶1的比例混合于加有10%马血清，5%FCS的培养基中进行共培养，培养2 d后，培养基换为5%马血清培养基，以后每隔2 d换液1次。

1.2.2 细胞大小的测量以及转分化情况检测 一种与MEF-2家族（包括MEF-2c、钙黏素、α-肌动蛋白、心房钠尿肽）广泛相关的抗体作为一抗作用于细胞心肌肌钙蛋白Ⅰ细胞增强因子2（MEF-2）。然后加入FITC标记的二抗。用藻红蛋白标记的抗人HLA-DR抗体鉴定人类细胞。细胞核用DAPI染色标记。倒置相差显微镜下观察细胞，100倍镜下测量细胞最大长度和表面积。用AxioCam 以及 AxioVision软件进行计算。共培养6 d后，人EPCs和大鼠心肌细胞均被标记上了藻红蛋白标记的具有人类特征的抗人HLA-DR抗体，用Cytofix/Cytoperm试剂盒进行透化，然后用FITC标记的抗α肌动蛋白抗体进行染色。用流式细胞分选仪对细胞（2×104个）进行分析。

1.2.3 转分化的EPCs的钙瞬变检测 心肌细胞和EPCs在盖玻片上共培养，6 d后用无磷台式溶解液清洗细胞，然后置于37 ℃，5%CO2浓度，5 μmol/L Fluo 4-AM条件下培养。30 min后将细胞移入用HEPES校正过的台式溶解液清洗过的显微镜室中。钙瞬变通过每一帧时间匹配的叠加进行均分。Fluo 4图像采集系统来获得图片。用Fluo 4荧光素（绿色荧光）检测Dil-acLDL标记（红色荧光）的人EPCs活细胞的钙瞬变。

1.3 统计学处理

所有数据用均数±标准差（x±s）表示，连续变量之间用未配对的双尾t检验，用ANOVA进行多重比较。用Mann-Whitney检验进行名义变量的比较。

2 结果

2.1 人外周血来源的内皮祖细胞可以转分化为心肌细胞

从人外周血中分离出的EPCs，培养3 d后，超过95%的贴壁EPCs表达内皮标志。将内皮祖细胞与大鼠心肌细胞按1∶4比例进行共培养，12 h即可见Dil-acLDL标记的EPCs黏附于心肌细胞（图1A）。6 d后可见一些人EPCs与大鼠心肌细胞相整合（图1B）。

2.2 细胞大小以及转分化情况

共培养6 d后，一些人EPCs与大鼠心肌细胞相整合（图1B）。与未整合的人EPCs相比，整合的人EPCs的细胞长度和表面积显著增加，这与其相邻的心肌细胞类似（图2）。与此同时，人EPCs和大鼠心肌细胞均被标记上了藻红蛋白标记的具有人类特征的抗人HLA-DR抗体，用Cytofix/Cytoperm试剂盒进行透化，然后用FITC标记的抗α肌动蛋白抗体进行染色。用流式细胞分选仪对细胞（2×104个）进行分析。最初并没有检测到双阳性细胞（图3）。相反，共培养6 d后，（8.23±1.56）%的人EPCs表达α-肌动蛋白（图4）。一些Dil-acLDL阳性以及人HLA阳性的EPCs表达心脏标志蛋白如肌钙蛋白Ⅰ，心房利钠肽以及一些心肌特异蛋白如α-肌动蛋白和MEF-2（图5）。此外在一些人EPCs中还观察到了肌组织（图5）。相反，在基础培养条件下，EPCs不表达肌源性标志蛋白（图3和图4）。

2.3 转分化的EPCs的钙瞬变

用Fluo 4荧光素（绿色荧光）检测Dil-acLDL标记（红色荧光）的人EPCs活细胞的钙瞬变。转分化的EPCs显示出与其相邻的心肌细胞同步的周期性振荡（图6）。单个钙信号的时间匹配均值显示，人EPCs和大鼠心肌细胞拥有相似的钙瞬变幅度和持续时间（图6C和图6D）。仅仅是转分化的EPCs显示出与大鼠心肌细胞相似的钙瞬变，而非转分化EPCs则没有（图6B和图6C）。

3 讨论

最近一项研究证明，小鼠胚胎内皮细胞能够分化为心肌细胞[5]。小鼠以及人类胚胎干细胞或者骨髓间充质干细胞同样也能够分化为心肌细胞，并且显示出结构以及功能活性[6-8]。动物体内试验表明体内注射EPCs能够促进心脏新生血管的形成并改善心脏功能[9]。因此，EPCs可能被用于细胞疗法，从而促进缺血性心脏病患者的血管再生，并且改善其心脏功能。但是究竟EPCs的转分化能力怎样还不为人所知。

本试验结果表明，当与大鼠心肌细胞共培养后，来自健康志愿者外周血的EPCs均有转分化为心肌细胞的能力。共培养6 d后，EPCs显示出心肌细胞的特征表型以及功能特性。这与小鼠胚胎内皮细胞或者人半胚胎脐静脉内皮细胞相似[5]。心肌细胞的一个关键性能是它的兴奋-收缩耦联。通过Fluo 4成像仪，在转分化人EPCs与大鼠心肌细胞间检测到相似振幅以及持续时间的钙瞬变。将转分化的人EPCs的钙瞬变与由人胚胎干细胞分化成的心肌细胞的钙瞬变进行比较也得到类似结果。总之，这些数据表明，人EPC具有获得心肌细胞表型以及功能特征的能力。

总之，在体外培养过程中，来源于健康成人外周血的EPCs在与大鼠心肌细胞共培养过程中能够转分化为心肌细胞。最后，这些细胞可能用于潜在的细胞疗法，进一步促进缺血性心脏病患者心脏组织再生。

参考文献

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（收稿日期：2014-09-10） （编辑：黄新珍）

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