一种高质量天门冬基因组DNA提取方法

摘要：针对天门冬[Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.]成熟叶片富含多糖、多酚、蛋白质及其他次生代谢物质的特点，采用改良CTAB法对其基因组总DNA进行提取，并对DNA进行质量检测。结果表明，改良CTAB法可从天门冬成熟叶片中获得纯度高、完整性好的总DNA，其OD260 nm/OD280 nm为1.86，OD260 nm/OD230 nm为2.36，浓度为390 μg/mL，产率达11.7 μg/g，多糖、多酚和RNA杂质被去除干净，无降解现象，说明该方法提取的天门冬基因组总DNA质量较高。

关键词：天门冬[Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.]；DNA提取；CTAB法

中图分类号：R282；Q7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）07-1678-03

A Method for Extracting High Quality DNA from Mature Leaves

of Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.

WEI Rong-chang1，2，WEI Shu-gen1，FU Jin-e1，KE Fang1，PAN Li-mei1，DONG Qing-song1，TANG Qi3

（1. Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants， Nanning 530023，China；

2. Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100193，China；3.Horticulture & Landscape College，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）

Abstract：The mature leaves of Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr. are rich in polysaccharides， polyphenols， protein and other secondary metabolism compounds preventing DNA extraction. The genomic DNA of A. cochinchinensis （Lour.） Merr. was extracted by improved CTAB method and DNA quantity was checked. The results showed that the genomic DNA was pure and integral without polysaccharides， polyphenols， RNA and degradation. The value of OD260 nm/OD280 nm and OD260 nm/OD230 nm were 1.86 and 2.36， respectively. The concentration and yield of DNA was 390 μg/mL and 11.7 μg/g. It can be concluded that this method could be used for extracting DNA with high quality from A. cochinchinensis （Lour.） Merr.

Key words： Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.； DNA extraction； CTAB method

天门冬[Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.]为百合科（Liliaceae）天门冬属（Asparagus Linn.）多年生攀援草本植物，又名天冬，以干燥块根入药。性寒，味甘、苦，含有甾体皂苷、多糖、氨基酸等多种活性成分，具有养阴润燥、清肺生津等功效[1]。目前，国内外对天门冬的研究主要集中在形态特征与生境习性[2]、药材鉴别[3]、化学成分[4，5]、药理与功效[6]、栽培技术[7，8]等方面，对其分子水平上的研究刚起步[9，10]，试验材料也仅限于幼嫩叶片，而天门冬成熟叶片富含多糖、多酚、蛋白质和其他次生代谢物质，大大增加了DNA提取的难度。本研究对传统CTAB法进行改良，获得了一种得率高、稳定性好、实用性广的天门冬成熟叶片基因组DNA提取方法，为开展天门冬分子生物学研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

天门冬新鲜叶片采自广西药用植物园科研基地，经中国医学科学院药用植物研究所马小军研究员鉴定。对种质资源圃中保存的17份天门冬种质资源进行收集，分别为百色野生大天冬、龙胜野生小天冬、阳朔栽培天冬、恭城野生小天冬、恭城野生大天冬、凌云野生大天冬、凌云野生小天冬、灵山野生小天冬、宁明野生小天冬、金秀野生小天冬、融水野生小天冬、靖西野生小天冬、靖西野生大天冬、田林野生大天冬、玉林野生大天冬、玉林野生小天冬、环江野生羊齿天门冬。每份种质选取生长状况良好的植株，采集30片健康成熟的叶片，用硅胶干燥保存，带回实验室中待用。

1.2 仪器与试剂

低温冰箱；高压灭菌锅；电子天平；水浴锅；微量移液器；微型高速离心机（珠海黑马医学仪器有限公司）；电泳槽和电泳仪（北京市六一仪器厂）；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；凝胶成像系统（美国Un-verbindlicher Verkaufspreis）。β-巯基乙醇；氯仿/异戊醇（24∶1）；3 mol/L NaAC（pH 5.2）；异丙醇；75%乙醇；无水乙醇；2×CTAB抽提液[100 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA（pH 8.0），2%CTAB，1%PVP]；0.1 TE（pH 8.0）缓冲液[1.0 mmol/L Tris-Cl，0.1 mmol/L EDTA]。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA的提取

1）称取成熟叶片（去主脉）1.0～2.0 g，置于研钵中，迅速用液氮将叶片组织研磨成细粉末状，然后将粉末适量分装于1.5 mL离心管中。

2 ）在各离心管中加入65 ℃预热的2×CTAB抽提液1 000 μL和β-巯基乙醇20 μL，轻弹混匀，使粉末充分湿润，置于65 ℃水浴锅中温浴15 min，其间上下倒置混匀数次。

3）12 000 r/min离心10 min，将上清液移至新的1.5 mL离心管中，弃沉淀。

4）在上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），轻轻颠倒混匀，12 000 r/min离心10 min，将离心后所得上清液转移入另一新的1.5 mL离心管中。重复抽提1次。

5）在上清液中先后加入1/10体积的3 mol/L NaAC（pH 5.2）和等体积异丙醇（NaAC和异丙醇均需提前预冷），轻轻翻转混匀，白色絮状沉淀出现后，放置于-20 ℃冰箱中冰浴1 h，沉淀DNA。

6 ） 12 000 r/min离心10 min，弃上清液，分别用75%乙醇、无水乙醇各洗涤沉淀1 次，倒扣于干净滤纸上自然风干5～10 min，视沉淀量的多少加入20～50 μL的0.1 TE（pH 8.0）缓冲液溶解，置于-20 ℃贮存。

1.3.2 DNA质量检测

1）DNA纯度及产率测定：取5 μL DNA样品，经TE稀释100倍后，用紫外分光光度计检测其在230、260、280 nm波长处的光吸收值。DNA的纯度用OD260 nm/OD230 nm和OD260 nm/OD280 nm来表示，当OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0，OD260 nm/OD230 nm>2.0时，DNA的纯度较高。若OD260 nm/OD280 nm<1.8时，说明DNA样品中有蛋白质污染；若OD260 nm/OD280 nm>2.0时，说明有RNA污染；而当OD260 nm/OD230 nm<2.0时，则表明DNA溶液中有盐和小分子杂质残留。根据OD260nm=1.0时溶液浓度为50 μg/mL计算DNA质量浓度和产率：

DNA质量浓度（μg/mL）=OD260 nm×50 μg/mL×稀释倍数

DNA产率（μg/g）=[DNA质量浓度（μg/mL）×TE体积（mL）]/试验材料用量（g）

2）DNA分子完整性测定：取3 μL DNA溶液样品，加适量溴酚蓝染色，于1.5%琼脂糖凝胶中电泳（电压≤5 V/cm）1 h，电泳缓冲液为1×TAE，电泳50～60 min后，经0.5 μg/mL溴化乙锭（EB）染色20～30 min，在凝胶成像系统上观察照相、记录。

3）SCoT-PCR扩增反应：用改良CTAB法制备的DNA作为模板，选用48号引物，其序列为5′-ACAATGGCTACCACTGGC-3′，进行SCoT-PCR扩增。25 μL反应体系中含10×Buffer 2.5 μL（10 mmol/L），Mg2+1.5 μL（1.5 mmol/L），dNTPs 0.5 μL（4.0 mmol/L），引物0.25 μL（10 μmol/L），Taq DNA聚合酶0.3 μL（5 U/μL），模板DNA 1 μL（50 μg/mL）。反应程序为：95 ℃预变性4 min，36个循环（95 ℃变性50 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min），72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。反应结束后取10 μL扩增产物置于琼脂糖凝胶中电泳，以Lambda DNA/EcoRⅠ+Hind Ⅲ Marker为标准分子量对照，EB染色后进行紫外光检测。

2 结果与分析

2.1 天门冬DNA纯度及产率

经紫外分光光度计检测，天门冬DNA样品的OD260 nm/OD280 nm=1.86（0.078/0.042），OD260 nm/OD230 nm=2.36（0.078/0.033）， 说明改良CTAB法提取的天门冬DNA纯度较高，没有多糖、多酚、蛋白质、RNA、盐和小分子杂质污染。计算得到DNA质量浓度为390 μg/mL，DNA产率为11.7 μg/g。

2.2 天门冬DNA分子完整性

将天门冬DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现，改良CTAB法提取的天门冬DNA电泳条带明亮、清晰，无拖尾、弥散现象，说明该方法提取的天门冬DNA分子完整性较好，无降解现象。图1为天门冬总DNA电泳图。

2.3 天门冬DNA SCoT-PCR扩增结果

用改良后的CTAB法提取的天门冬DNA作为模板进行SCoT-PCR扩增。取PCR扩增产物10 μL进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，所得SCoT-PCR扩增条带清晰，带型丰富，无杂带，可以用于天门冬种质资源遗传多样性分析。

3 小结与讨论

高质量基因组DNA的提取是进行分子标记等分子生物学研究的基础[11]，天门冬成熟叶片富含多糖、多酚、蛋白质和次生代谢物质等，在DNA提取过程中，此类物质可与DNA共沉淀、形成胶状难溶物或产生褐变，严重影响DNA的质量[12，13]。而幼嫩新生组织中的多糖、多酚和次生代谢物质较少，细胞易于破碎，DNA提取产率高。因此，应选择幼嫩、代谢旺盛的新生组织作为提取DNA的材料[14]。

通过一系列措施，有效控制了天门冬成熟叶片中多糖、多酚、蛋白质和次生代谢物质等对DNA提取的影响。首先，CTAB既能有效裂解植物的细胞壁，又能溶解细胞膜，可较好地去除多糖等杂质；其次，高分子合成树脂PVP作为一种酚的络合物，同时含有亲水基团和亲油基团，易溶于极性的有机溶剂，可有效地去除酚类物质[15]；而β-巯基乙醇的巯基能与酚类物质竞争氧，从而避免其氧化成醌类[16]，但PVP和β-巯基乙醇单独使用效果不好，只有将二者按一定比例配合使用效果才理想。

改良CTAB法提取植物基因组DNA过程中，通过氯仿-异戊醇抽提，除去蛋白质等杂质，试验发现，抽提1次，尚有杂质残留，抽提3次，DNA产率降低，而抽提2次的DNA质量较高，这与陆嘉惠等[17]的报道基本一致。

植物基因组DNA提取方法较多，但其原理基本相同，主要包括破碎细胞、裂解细胞或组织，以去诟剂溶解细胞膜，从而促使蛋白质变性，再用氯仿-异戊醇等有机溶剂对DNA进行抽提纯化。由于核酸基本集中在细胞内，所以研磨的质量好坏是提取基因组DNA的关键，只有充分研磨，细胞才能破碎，核酸才得以释放[18]。

本试验是在CTAB法的基础上进行改良的，以传统的CTAB法为对照，但是由于成熟叶片富含多糖、多酚、蛋白质和其他次生代谢物质，传统的CTAB法无法提取天门冬的DNA，电泳结果为空白，故本试验只对改良CTAB法进行分析和PCR扩增验证。

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