大肠杆菌感受态细胞制备及转化条件优化

材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌菌株 E.coli DH5α由笔者所在实验室-70 ℃保存。载体pGM-T、pMD-18T Vector 购于天根生化科技（北京）有限公司、大连宝生物公司。0.1 mol/L CaCl2溶液所用无水CaCl2为国产分析纯。氨苄青霉素（ampicillin）购于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 仪器

HITACHI SCR20BA 高速冷冻离心机，HH-6数显恒温水浴锅，MP 200A分析天平，Eppendorf移液器，超净工作台。

1.3 方法

1.3.1 准备工作 EP管、枪头、枪头盒、100 mL三角瓶、培养皿等进行高压蒸汽灭菌，100 ℃烘干，-20 ℃冷冻备用。

1.3.2 药品配制 0.1 mol/L CaCl2溶液：取1.11 g无水CaCl2，用容量瓶定容至100 mL，分装置于50 mL三角瓶中，高压蒸汽灭菌，4 ℃保存备用。100 mg/mL氨苄青霉素（Amp）：取 1 g Amp溶于100 mL无菌水中，分装至2 mL EP管中，滤膜过滤，-20 ℃保存备用。LB培养基：胰化蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，琼脂粉14.0 g，溶于950 mL无菌水中，用5 mol/L NaOH调节pH值至7.0，定容至1 L，高压蒸汽灭菌，分装至培养皿。

1.3.3 菌种活化 将DH5α菌种在 LB 固体培养基平板上交错划线，37 ℃ 过夜培养，获得良好单斑。取无菌试管加入2 mL LB（不含抗生素）培养基，挑取良好单斑接种于试管中，37 ℃ 摇床培养过夜。按1 ∶ 100的比例，取 0.5 mL 菌液转接至含有 50 mL LB 液体培养基的三角烧瓶中，37 ℃ 摇床培养 2～3 h，直至 D600 nm 值达 0.4左右[9]。

1.3.4 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 将菌液分装至预冷无菌的1.5 mL EP管中，于冰上放置10 min，4 ℃ 4 000 r/min 离心10 min。将离心管倒置以倒尽上清液，用移液枪将倒不尽的上清液吸出，加入1 mL 0.1 mol/L冰冷CaCl2 溶液，立即在漩涡混合器上混匀，冰上放置30 min。4 ℃ 4 000 r/min 离心10 min，弃上清液，倒置1 min，加入1 mL 01 mol/L 冰冷CaCl2 溶液，移液枪轻轻吹打垂悬细胞，冰上放置30 min。4 ℃ 4 000 r/min离心10 min，弃上清液，倒置 1 min，每管中加入60 μL冰冷0.1 mol/L CaCl2 垂悬细胞，冰上放置 2 h，即可用于转化;也可加入体积分数为40%的甘油，-70 ℃超低温保存备用[10]。

1.3.5 质粒转化 将5 μL质粒DNA直接加入100 mL感受态细胞中，手指轻弹管底部混匀，冰浴30 min。42 ℃水浴热激，设置20 、30、40、60 、80 、90 、100 、120 s 8个时间梯度，设置2、4、6 、8 min 4个冰浴冷却时间。加入900 μL LB液体培养基（不含抗生素），37 ℃ 180 r/min振荡培养1.0～1.5 h。取上述转化混合液100 μL，滴到固体LB平板培养皿（含抗生素100 μg/mL Amp）中，用玻璃涂布棒涂布均匀。正面向上放置30～60 min，待表面菌液完全被培养基吸收，倒置培养皿，37 ℃过夜培养12～16 h[11]。

2 结果与分析

2.1 不同热激时间对转化效率的影响

菌种活化时，每隔30 min测1次D600 nm值（表1）。

表1 大肠杆菌DH5α活化后的D600 nm值

时间（h） D600 nm 时间（h） D600 nm

0 0 2.5 0.099

0.5 0.035 3.0 0.112

1.0 0.043 3.5 0.209

1.5 0.065 4.0 0.389

2.0 0.078

以常用CaCl2 法为基础，在冷却时间相同的情况下，42 ℃水浴热激，设置20 、30、40、60 、80 、90 、100 、120 s 8个时间梯度，结果表明，热激100 s的转化效率最高，90 s次之（图1）。

2.2 不同冷却时间对转化效率的影响

在热激100 s的前提下，对不同冷却时间进行比较，设置2、4、6、8 min 4个冰浴冷却时间，由图2可知，冷却时间对转化效率影响并不大，6～8 min冷却时间的转化效率略高。

2.3 离心管大小对转化效率的影响

本试验将常规CaCl2 法中50 mL离心管改成了1.5 mL EP管，降低了感受态细胞制备后分装时受到污染的风险，转化效率也相对较高。

3 结论与讨论

在分子生物学试验中，通常利用质粒的转移性及自我复制功能将重组质粒转化入大肠杆菌宿主细胞内，以达到目的基因复制、增殖及体外表达的目的[12]。此过程中，受体细胞感受态质量的好坏以及转化过程的操作方法直接影响转化效率高低。很多研究人员在遇到不能获得良好的转化效率问题时，经常怀疑重组质粒构建时连接反应的影响，很容易忽略大肠杆菌感受态细胞制备及转化的环节，有些实验室过度信任商业公司提供的感受态细胞，导致试验陷于停滞状态却找不到原因，试验效率受到很大影响[13-18]。在具体操作过程中，感受态细胞制备及转化效率常因各种原因产生不稳定性，因此有必要针对特定菌株对其感受态制备与转化进行条件优化。本研究以常规CaCl2法为基础，通过改变离心管大小、不同热激时间、不同冷却时间对感受态细胞制备及转化条件进行条件优化，结果表明，42 ℃热激的最佳时间为100 s，最适冷却时间为6～8 min。本研究将常规的50 mL离心管改成了 1.5 mL EP管，有效降低了分装过程中可能产生的污染风险，简化了试验程序，提高了转化效率，为基因克隆试验成功提供了保障，同时节约了成本。

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