新疆黑蜂胶体外抑制大肠杆菌生物膜的研究

[摘要] 目的 建立大肠杆菌生物膜（BF）体外模型，研究不同浓度新疆黑蜂胶对大肠杆菌体外培养BF形成及清除的影响。 方法 采用微孔板改良法复制大肠杆菌体外BF模型，采用试管二倍稀释法测定新疆黑蜂胶的最低抑菌浓度（MIC），并检测黑蜂胶不同浓度对大肠杆菌BF形成的影响，同时通过检测新疆黑蜂胶对成熟BF中活菌数的影响，评价其对成熟BF的清除作用。 结果 新疆黑蜂胶醇提物对大肠杆菌的MIC为12.50 g/L，当浓度为6.25 g/L时新疆黑蜂胶就可在早期干扰细菌BF的形成，作用呈剂量依赖性；当浓度达到50.00 g/L时，其抑制BF的作用与庆大霉素相比差异无统计学意义（P > 0.05）。在对成熟BF的清除作用中的研究中，当黑蜂胶浓度达12.50 g/L时，能有效清除成熟BF，而当浓度达到50.00 g/L时，其清除成熟BF的作用与庆大霉素相比差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 新疆黑蜂胶醇提物在体外具有抑制大肠杆菌BF形成的作用，且能通过破坏已形成的BF起到抗菌作用，为临床辅助治疗耐药性感染，提供实验依据。

[关键词] 新疆黑蜂胶；最低抑菌浓度；大肠杆菌；生物膜

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）12（c）-0018-04

Study of inhibition effect for the biofilm formation of Escherichia coli by Xinjiang black propolis in vitro

ZHU Ming XU Qi WU Yehua XIE Tianyu LI Fangfang SHAO Tingting CUI Yajing ZHAO Shuyue

Immunology Teaching and Research Office of Pre-clinical College， Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830011， China

[Abstract] Objective To establish the Escherichia coli biofilm （BF） and investigate the effect of different concentration of Xinjiang black propolis extract on the formation of BF. Methods The Escherichia coli BF was induced in vitro by MPP improved method. Minimal inhibitory concentrations （MICs） were measured by doubling dilution. Escherichia coli were treated with different diluted Xinjiang black propolis extract and the formation and growth of Escherichia coli on BF were tested by determination of viable bacterial counts， and the scavenging effect of mature BF was evaluated. Results The MIC of Escherichia coli was 12.50 g/L of Xinjiang black propolis extract. 6.25 g/L of black propolis extract could inhibit the formation of BF， and the effect was dose dependent. When the concentration was 50.00 g/L， the inhibitory effect of the BF was no statistically significant difference compared with Gentamicin （P > 0.05）. In the study of the clear role in mature BF， when the black propolis concentration was 12.50 g/L， it could effectively remove mature BF， and when the concentration was 50.00 g/L， its effect in removal of mature BF， there was no significant difference compared with Gentamicin （P > 0.05）. Conclusion Xinjiang black propolis extract can effevtively inhibit the BF′s formation of Escherichia coli in vitro. It can also destroy the mature BF， and can provide experimental basis for clinical auxiliary treatment of resistance to infection.

[Key words] Xinjiang black propolis； MIC； Escherichia coli； Biofilm

细菌生物膜（bacterial biofilm，BF）是细菌为抵抗不利环境，所形成的一种独特的存在方式，由细菌及其分泌的多聚物组成[1]。膜内细菌由于生物膜的保护，不容易被机体及抗生素清除，常规剂量的抗生素和消毒剂作用均无效，须加大药物剂量和延长用药时间，但伴随而来的是耐药菌株的产生，临床上常导致疾病迁延不愈或急性发作，给治疗带来巨大困难[2]。大肠埃希杆菌是常见的肠道致病菌和条件致病菌，也是在特定环境中极易形成生物膜的细菌，该菌是目前造成食源性疾病、慢性肠炎、腹膜炎及严重医院内感染的主要原因[3]，也是临床上造成外科手术伤口植入物[4]、引流管、人工关节置入[5]等相关感染的重要原因。本研究通过微孔法构建大肠杆菌生物膜体外模型，探讨不同浓度新疆黑蜂胶对BF形成的影响及其抗菌效果，为临床用药及新疆特色黑蜂胶的应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

大肠杆菌（ATCC25922）为中国生物药品鉴定所提供。将购置的标准菌株接种于营养琼脂平板上37℃、24 h进行复苏传代备用。取6 h细菌培养液，经麦氏比浊法，调整菌液浓度为1012/L，并用营养肉汤1000倍稀释，作为工作浓度。通过倾注平板法计数，得出大肠杆菌实验浓度为4×108/L。

1.2 黑蜂胶提取物的制备[6]

将新疆伊犁地区尼勒克县的黑蜂胶和水按1∶8比例75℃水浴除蜡，用水浴法以25倍原料中的70%乙醇水浴液在75℃浸提过夜，获得提取物，调整浓度为100 g/L，过滤除菌，4℃冰箱保存备用。

1.3 仪器

酶标仪（iMark；Bio-Rad公司），生物安全柜（型号：1300 SERIES A2，Thermo公司），37℃恒温培养箱（DNP-9162型），Olypus光学显微镜。

1.4 最低抑菌浓度（MIC）测定

采用试管二倍稀释法测定黑蜂胶对大肠杆菌实验菌株MIC。敏感性分类和质量控制均采用美国临床检验标准委员会[NCCLS（2004）]推荐标准[7]。

1.5 大肠杆菌生物膜微孔板模型的构建

根据参照文献稍作改进[8-9]，将稀释为实验浓度的大肠杆菌菌液置于96孔板中，四周加培养基作为空白，置于恒温培养箱中培养24 h，取出，测其600 nm处的OD值。将菌液倾出，用PBS反复清洗后，加入结晶紫染色30 min，再将结晶紫倾出，洗净，加入脱氧胆酸钠溶液，30 min后测其600 nm处的OD值。

1.6 黑蜂胶抑制大肠杆菌BF形成的作用

将实验浓度的大肠杆菌接种于96孔板，分别加入黑蜂胶系列浓度培养液（50.00、25.00、2.50、6.25 g/L）和新鲜配制庆大霉素溶液，并设置不含药物的黑蜂胶浓度0.00 g/L组（0.00 g/L）和不含细菌培养液的阴性对照组。将96孔板置于恒温培养箱中培养24 h后测定光密度值（波长=600 nm），计算出细菌的抑制率，其公式为：抑制率=（溶剂空白值-样品值）/（溶剂空白值-阴性对照值）×100%[10]，并做活菌计数。

1.7 黑蜂胶对成熟大肠杆菌BF的清除作用

培养24 h的大肠杆菌生物膜，用PBS反复冲洗，去掉浮游细菌后，分别加入含黑蜂胶系列浓度的培养液，并设置不含药物的黑蜂胶浓度0.00 g/L组及庆大霉素组，37℃培养8、18、24 h后，收集培养物，PBS缓缓清洗3次，再用连续稀释法进行活菌计数，每次测定均重复测3次，计算平均值。

1.8 统计学方法

采用统计软件SPSS 12.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MIC测定结果

黑蜂胶对大肠杆菌的MIC测定结果为12.50 g/L，庆大霉素对大肠杆菌的MIC为0.25 g/L。

2.2 黑蜂胶对大肠杆菌生物膜细菌抑制作用

从开始建立BF模型时即分别加入黑蜂胶系列浓度培养液，新鲜配置庆大霉素溶液，并设置不含药物的黑蜂胶浓度0.00 g/L组，药物对大肠杆菌的抑制见图1。经不同浓度黑蜂胶作用后，菌液的OD值下降，当黑蜂胶浓度为6.25 g/L时，与正常对照孔相比差异具有统计学意义（P < 0.05）。随着黑蜂胶浓度的增加，OD值下降明显，可见黑蜂胶的抑菌作用有明显的剂量依赖性。

图1 不同浓度黑蜂胶对大肠杆菌的影响

同时载体表面黏附的活菌计数结果显示，黑蜂胶组高浓度组与庆大霉素组载体表面黏附活菌数差异无统计学意义（P > 0.05），但与黑蜂胶浓度0.00 g/L组（0.00 g/L）相比明显减少（P < 0.05）。黑蜂胶其他浓度与对照组相比差异无统计学意义（P < 0.05），且随着浓度的增加黑蜂胶对大肠杆菌的抑制作用越明显。以上结果说明，黑蜂胶和庆大霉素均能在体外明显抑制大肠杆菌BF的形成，且两者的抑制效果相仿；黑蜂胶对大肠杆菌体外生物膜的形成的抑制作用具有剂量依赖性。

2.3 不同浓度黑蜂胶对成熟BF的清除作用

在大肠杆菌生物膜体外形成后，不同浓度的黑蜂胶作用于已形成的BF。结果显示，当黑蜂胶6.25 g/L浓度作用生物膜细菌，在8、18、24 h时BF的活菌数与对照组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。当黑蜂胶浓度增至12.50 g/L时，对大肠杆菌在8 h时，就显示出明显抗菌活性，与空白对照相比差异有统计学意义（P < 0.05）。当浓度增至25.00、50.00 g/L，在8 h后BF中的活菌数明显减少，与黑蜂胶浓度0.00 g/L组比较差异有统计学意义（P < 0.05），但24 h内BF中的细菌不能完全被清除。各时间段之间活菌数差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

表1 成熟BF经不同浓度黑蜂胶作用后活菌计数统计（×106cfu/L，x±s）

注：与黑蜂胶（0.00 g/L）比较，*P < 0.05

3 讨论

生物膜是细菌在不利的环境中形成的优势型，是细菌为了适应不利生存环境而形成的一种与浮游相对应的存在形式[11]。与浮游细菌相比，生物膜细菌对抗生素的抗性可提高达到上千倍[12]。细菌菌体被其自身分泌的多种糖蛋白包裹，形成膜状物，受到生物膜的保护，膜内菌能够逃逸机体免疫系统的攻击以及抗菌药物的杀伤，致其在体内播散，并表现出高度耐药性，从而造成慢性、难治性感染。并且随着医学科技的发展，生物材料的应用逐渐增多，医学中植入和介入性操作增多，而细菌生物膜易于固着在异物和坏死组织表面，导致 > 60%的感染是由细菌生物膜造成的，且相关感染发生率逐年上升。因此，如何减少由于生物材料植入体内形成生物膜也已成为研究的热点问题[13]。有研究表明，重症监护病房直入性导管附着的细菌主要有铜绿假单胞菌、大肠杆菌及葡萄球菌。在腹膜透析中，由于透析管上细菌生物膜的形成[14]，可并发腹膜炎，这也是导致技术失败退出腹透治疗的一种主要原因。另外，在导管相关尿路感染（CAUTI）中，细菌生物膜[15]的形成导致了1/3导管相关尿路感染无法控制。因此，医源性生物膜感染越来越多地引起了临床的重视。

一般认为，大肠杆菌是最常见的G-肠道致病菌和条件致病菌[3]，也是医院院内感染的主要致病菌。在特定环境中大肠杆菌是极易形成BF的细菌，一旦形成BF，常规剂量的抗生素和消毒剂均会作用无效，须加大药物剂量和延长用药时间，但伴随而来的是耐药菌株的产生，致使感染迁延不愈，因此，作为细菌耐药主要机制之一的生物膜近年来已成为抗感染领域的重要课题[16]。已有多项试验研究表明中药的抗菌活性显著[17-18]。而且由于体外生物膜模型容易建立且耗时短成本低，故能见到在不同材料表面所构建的模型，特别是基于微量培养板的抗菌抗生物膜药物筛选非常方便快捷[19]。本课题组近年来通过以微量培养板为主所构建的大肠杆菌生物膜模型，从天然黑蜂胶中提纯出抗大肠杆菌的效成分，并进一步发现部分该成分与庆大霉素的抗菌作用相似。研究还显示，1倍MIC浓度的黑蜂胶可以有效抑制大肠杆菌BF的形成并对已形成的BF具有清除作用，这种清除作用呈剂量依赖性，当黑蜂胶浓度达到50 g/L时，其抑菌和杀菌作用于庆大霉素无显著性差异，提示黑蜂胶具有抗细菌生物膜的功效。

我国是养蜂大国，蜂胶资源丰富。蜂疗具有“廉、便、新”的特点，应加强研究与推广应用。蜂胶是一种天然生物活性物质，作为天然免疫刺激剂可以强化免疫系统，增强免疫细胞的活力[20]。同时，蜂胶还可作为一种广谱抗生素，在抗菌、抗病毒作用方面具有鲜明的作用。新疆黑蜂胶是由生长在新疆伊犁地区尼勒克县的黑蜂形成，虽然其总黄酮的含量低于目前国内外其它地区的蜂胶[21]，但其抗菌、消炎的作用未受到影响[22]。本研究就新疆黑蜂胶对大肠杆菌生长及其生物膜形成的影响做初步探讨。结果显示，黑蜂胶在体外能有效抑制大肠杆菌BF的形成，与庆大霉素相比该作用效果无显著性差异。但由于黑蜂胶由多种成分组成，其抑制BF形成及清除BF的具体机制还有待今后更进一步的研究。尽管黑蜂胶可以干预细菌生物膜的形成，但蜂胶当中有效成分相对复杂，其干预作用很可能是多成分多途径的综合作用结果。目前的研究相对集中在体外实验，并不能完全模拟真实的体内作用过程，因此建立体内动物模型，对蜂胶进行全组分提取，定向分离，研究不同组分的药效机制，尤其是信号转导等，将成为研究的重点。另外，研究结果还有待于进行临床用药试验，以确定疗效。不过黑蜂胶药物毒理实验结果显示受试药物无明显毒性作用，提示黑蜂胶具有开发应用的潜力。相信随着对生物膜的研究不断深入，战胜BF只是时间问题。同时，随着科学技术的不断发展，对蜂胶的化学组成、生物药理效应、临床各科应用等方面地深入研究，对蜂胶医学领域的新老课题进行多角度、立体研究，不断丰富发展蜂胶医学，这必将产生巨大的社会效益和经济效益，从而为蜂胶更广泛的应用开辟了崭新前景。

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（本文编辑：卫 轲）

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