血清对细胞摄取DNA四面体纳米结构行为的影响

材料的细胞学纳米载体的设计和优化提供了新思路。

关键词 DNA纳米结构； DNA四面体； 细胞摄取； 血清； 胞吞途径

1引 言

自组装 DNA纳米结构作为一种新的纳米材料，已被用于生物传感、纳米光子学等多个领域＼[1＼]。核酸分子独特的碱基互补配对的特性，赋予了DNA结构优异的可精确设计性和位点修饰的可寻址性，因此通过精确的设计和高效的制备方法，研究者已经制备出各种不同尺寸、形状和维度的 DNA 纳米结构＼[2～5＼]。此外，作为一种生物分子，DNA纳米结构自身具有良好的生物相容性和可降解能力，因而在生物医学领域有着巨大的应用前景＼[6～12＼]。DNA四面体（etrahedral DNA nanostructure， DNs）是一类合成方法简单、结构稳定的DNA三维纳米材料，通过4条DNA单链间的碱基互补配对作用能够直接形成金字塔型的纳米结构＼[13＼]。核酸（如单链、双链DNA等）本身表现为负电性，会与细胞膜产生静电斥力，通常需要借助于带正电荷的转染试剂才可以进入细胞。然而DNs与一般负电性核酸结构不同，在没有转染试剂辅助的情况下，可以直接被哺乳动物细胞大量摄取，表现出良好的生物应用前景。

本课题组前期围绕DNs作了大量工作，通过单颗粒示踪技术研究了哺乳动物细胞对DNs的内吞行为及其在细胞内的运输规律。发现DNs通过小窝蛋白介导的内吞机制快速进入细胞，随后借助微管依赖的途径，在细胞内被有序运输到细胞溶酶体内，整个过程中DNs基本保持其结构的稳定性，改变DNs进入溶酶体的宿命是其成为有效的运输载体的关键，因此采用核定位序列功能化的DNs来逃脱溶酶体进而运输到细胞核内＼[14＼]。本课题组还研究了DNs的体内分布代谢以及DNs负载负载CpG后的效应等＼[15＼]。但到目前为止，关于DNs与细胞的研究均未考虑环境中胎牛血清（FB）的影响。FB含有各种血浆蛋白、多肽、生长因子等，可通过吸附等作用在纳米材料表面形成蛋白冠（Protein corona），改变纳米颗粒的表面性质，影响细胞摄取行为＼[16，17＼]。表面带负电荷的DNs在含有FB的环境中，也可能会受到FB中带正电的蛋白影响，改变其细胞内吞机制。

在本研究中，借助共聚焦成像技术和流式细胞术，比较了FB对细胞摄取DNs速度的影响。12 h内，在含有FB的培养基中，DNs被eLa细胞摄取的速度大于不含FB的情况，表明 FB有助于增加DNs的摄取速度。随后采用抑制剂的研究方法，研究了FB对DNs摄取途径的影响。实验结果表明，FB并没有改变DNs通过小窝蛋白依赖的胞吞途径进入细胞的机制。本研究揭示了血清的存在主要通过增加内吞的形式影响到DNs与细胞的相互作用，为DNs作为智能药物载体的应用奠定了基础。

2实验部分

21仪器与试剂

UV3010紫外分光光度计（日本日立公司）； F900荧光分光光度计（英国爱丁堡仪器公司）； Applied Biosystems Veriti 96 well hermal Cycler PCR仪（美国赛默飞世尔公司）； PLC系统配Waters 1525泵，Waters 2998光电二极管阵列检测器（美国Waters公司）； EC色谱柱（Yarra 3 μm EC4000：Analytical 300 mm × 78 mm，美国Phenomenex公司）； NanoPhotometer P330核酸蛋白质微量定量仪（德国Implen公司）； Box ChemiXL化学发光成像系统（美国yngene G公司）； Nano Z90粒度仪（英国马尔文公司）； Bruker Multimode 8， Nanoscope Ⅲa原子力显微镜（德国布鲁克公司）； NL10 AFM针尖（美国 Veeco 公司）； Lecia C P8激光共聚焦显微镜（德国莱卡公司）； BD FACArray Bioanalyzer流式细胞仪（美国BD公司）。

三羟甲基氨基甲烷和NaCl（色谱纯，美国igmaAldrich公司）； 甲基β环糊精（Methylβcyclodextrin， MβCD， 美国igmaAldrich公司）； GelRed DNA染料（Biotium）； 其余試剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂公司； Dio和BCA蛋白试剂（江苏碧云天有限公司）； MEM培养基，FB，Penicillin，rypsin，treptomycin和Lglutamine（美国Life echnology公司）； eLa细胞（上海生命科学研究院）； 35 mm玻璃底细胞培养皿（杭州生友生物技术公司）。MWCO 30 KDa 超滤管（美国Millipore公司）。实验所用水为Milli Q超纯水（18 MΩ cm，美国Millipore公司）。荧光标记的寡核苷酸（美国Invitrogen公司）采用PLC纯化。核酸序列见表1。

22DNs的组装、纯化和表征

DNs由化学计量严格等同的四条单链DNA通过一步退火法进行组装。四条DNA单链在M 缓冲液（10 mmol/L risCl， 5 mmol/L MgCl2， p 80）中等摩尔混匀， 置于PCR 仪中，按照预设程序（95℃加热10 min， 迅速冷却至4℃， 保持20 min）退火， 即完成组装。合成的DNs终浓度为1 μmol/L。

PLC所用流动相为25 mmol/L risCl， 450 mmol/L NaCl，p 74，流速1 mL/min，检测波长260 nm。收集产物，进一步使用截留分子量为 30 KDa的超滤管进行浓缩，同时将高盐流动相置换为M缓冲液。纯化后的DNs稀释为1 μmol/L，4℃储存。纯化前后的DNs使用6% 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），冰浴条件下进行表征，电压100 V，电泳时间2～3 h，电泳结束后使用GelRed染色30 min，使用化学发光成像系统成像。

使用粒度仪对纯化后的DNs的水合半径和Zeta电位进行测量，并用原子力显微镜（AFM）对其形貌进行表征。将预先形成好的 DNs（10 nmol/L）滴在新剥离的云母表面，并在室温下孵育3 min，然后用蒸馏水冲洗，吹干。在气相下采用轻敲模式，得到的AFM图像用Nanocope软件进行处理。

23荧光标记的DNs稳定性表征

纯化后的DNs（浓度1 μmol/L）分别与MEM培养基（含10% FB）和细胞裂解液（超声离心的方法制备，BCA蛋白试剂盒测得蛋白浓度为057 mg/mL，）混合（1∶4， V/V），37℃孵育0、2、4、8和12 h。孵育结束后，样品统一使用6% PAGE进行表征，并使用ImageJ自带Gels插件进行定量分析。

终浓度为100 nmol/L DNsCy3分别在含有10% FB的MEM培养基（FB+）和不含FB的MEM培养基（FB-）中孵育0、12和24 h，测量两组试验样品在对应时间点的荧光强度，每个时间点平行测量3次，得到24 h内DNs的荧光强度在不同环境中的变化。

24细胞培养

eLa细胞在含10% FB，100 units/mL青霉素，100 units/mL链霉素和2 mmol/L LGlutamine的MEM培养基中，在37℃，5% CO2环境下培养。

25细胞摄取DNs

在直径35 mm玻璃底培养皿中铺板5 × 104 eLa细胞用于共聚焦成像，在24孔板中每孔铺板8 × 104 eLa细胞用于流式细胞仪检测。 24 h后，用PB洗3次。将Cy3标记的终浓度为100 nmol/L的DNsCy3分别和细胞在MEM （FB+，即含有FB）或MEM（FB-，即不含有FB）中孵育2、4、6、8和12 h。到达特定时间点后，用PB洗3次去除细胞外四面体，使用流式细胞仪检测测在FB存在和不在的条件下，细胞对DNsCy3的摄取量。用Dio染膜10 min，PB洗涤3次，更换新的MEM（FB-）培养基，采用共聚焦显微镜成像分析DNsCy3在细胞内摄取量和分布＼[18＼]。

26DNs的摄取途径

eLa细胞铺板24 h后，用PB洗3次，加入材料前使用抑制剂ucrose（450 mmol/L）和MβCD（10 mmol/L）孵育30 min，然后再与DNsCy3孵育6 h。

27激光共聚焦显微成像

细胞内的荧光信号采用配备活细胞系统的Lecia C P8激光共聚焦显微镜成像。Cy3标记的DNs采用561 nm氦氖激光器激发，检测通道设置为570～620 nm。Dio标记的细胞膜采用488 nm氩离子激光器激发，检测通道设置为500～550 nm。采用NA=140 63X的油镜成像。

28流式细胞仪检测条件

采用流式细胞仪检测前，去除细胞中培养基，用PB洗涤3次。每孔加入02 μL胰蛋白酶，37℃消化1 min后，加入300 μL的培养基终止消化。通过前散射和横向散射确定细胞的大小和密度以圈定细胞。平行进行3组样品测定，每次采集10000个细胞，Gate>85%。

3结果和讨论

31DNs纳米结构的合成、纯化和表征

本课题组之前的工作中发现，边长20 bp的DNA四面体负载CpG在RW264细胞中可引发免疫效应＼[15＼]，但培养环境对这种尺寸的DNs与细胞相互作用的影响还不清楚。本研究考察了血清对DNs细胞摄取行为的影响。首先，将4条边长63个碱基的DNA单链通过自组装得到边长20 bp的DNs纳米结构。然后，采用非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE）对自组装得到的DNs产率进行表征。如图1A所示，对应20 bp DNA marker位置＼[14＼]，最下方的条带为DNs。尽管DNs单体产率很高（大于50%），在目标条带上方依然存在低迁移率的四面体多聚体和错配结构。为了消除除其它结构对后续实验的干扰，使用分子排阻色谱（ECPLC）系统对合成后的产物进行纯化。如图1B所示，多聚体和错配结构分子量大，出峰早于单体结构。在92 min处收集单体，使用超滤管（MWCO=30 kDa）浓缩和置换缓冲液＼[19＼]。浓缩置换后的产物，单体DNs的比例超过95%（图1C）。激光粒度仪的测量结果显示，单体DNs的水合半径为（121±23） nm，表面Zeta电势为

ymbolm@@ 529 mV（图1D）。AFM扫描的图像显示，DNs为大小均一、中空的单颗粒结构（图1E）＼[20＼]。

32DNs结构的稳定性

DNs结构的完整性直接影响其生物学应用。分别将DNs在含有FB的培养基和细胞裂解液中孵育，用PAGE对完整的DNs进行了定量表征。由图2A可见，DNA纳米结构在细胞裂解液中经过12 h孵育，依然有90%的单体DNA稳定存在； 在含有FB的培养基中，孵育12 h后，完整DNs结构的比例也超过80%，表明DNs结构在生物体系中具有良好的稳定性。为了考察环境中的蛋白分子是否会对标记的Cy3荧光的强度产生影响，我们分别测量了FB+和FB-条件下培养基中DNsCy3的荧光强度，结果表明在24 h內FB不影响Cy3荧光的强度（图2B）。

33FB对细胞摄取DNs的速度的影响

使用激光共聚焦显微镜对FB+和FB-条件下eLa细胞摄取DNsCy3的情况进行了分析，并通过流式细胞仪测量了不同时间点下DNsCy3的内吞量（图3）。结果表明，在12 h内随时间的延长，DNs在细胞内累积并逐渐向核周围聚集。进一步对比两种条件下不同时间点摄取的差异，发现在2 h时，两者不存在差别，而在4 h后FB+组的DNs摄取量远高于FB-组，且差别逐渐增加（图3A）。在细胞成像实验中，使用Dio染色细胞膜，实验结果清晰地证明了红色的DNsCy3并未吸附在绿色的细胞膜上，因而，荧光强度的差别确实反映了细胞摄取量的差别（图3B）。流式细胞和共聚焦成像实验显示，培养基中的FB增加了细胞对DNs的摄取速度。

34FB对细胞摄取DNs途径的影响

为了进一步研究摄取速度的差别是否由摄取途徑的不同造成的，使用抑制剂的方法研究在FB+和FB-的条件下，DNs摄取途径的差异＼[21＼]。细胞对纳米材料的摄取途径主要是受体介导的内吞途径，而受体介导的内吞途径主要分为3种：网格蛋白介导的内吞途径、小窝蛋白介导的内吞途径和两种都不依赖的受体介导的内吞途径＼[22，23＼]。本课题组之前的研究工作发现，DNA纳米结构在FB存在的情况下，是通过小窝蛋白（Caveolin）介导的内吞途径，网格蛋白相关抑制剂并不能减少细胞对DNA纳米结构的摄取＼[14＼]。本研究考察了DNs在FB存在和不存在的条件下的摄取途径的变化情况。

为了研究这两种途径在DNs进入细胞的过程中所起的作用，分别采用两种途径的抑制剂选择抑制其中的一条途径，观察摄取量的变化。MβCD能够去除细胞膜胆固醇、影响脂筏、破坏小窝蛋白小泡的形成，进而抑制小窝蛋白介导的胞吞途径； 而蔗糖是网格蛋白依赖途径的抑制剂＼[23＼]。实验结果表明，在蔗糖作用下，DNs摄取量相对于对照组没有减少； 而在MβCD处理后，不论是否存在FB，DNs摄取量都大幅减少（图4A）。从共聚焦显微镜图可见，MβCD抑制DNs进入细胞，有很多DNs残留在细胞膜表面和Dio共定位，MβCD的抑制效果超过FAC得到的抑制比例（图4B）。对比DNs在FB+和FB-中被MβCD的抑制效果发现，DNs在FB+中相对于对照组下降比例更高，更容易受到抑制剂影响。抑制剂的实验结果表明，血清不改变细胞摄取ela细胞的途径。

4结 论

已有研究表明，环境因子对无机纳米材料的细胞学行为具有关键的调控作用。本研究选取DNs为代表性的DNA纳米材料，结合激光共聚焦显微成像和流式细胞术，定性和定量地研究了细胞培养液中的FB对于细胞摄取DNs的行为的影响。结果表明，尽管FB并未改变DNs摄取途径（小窝蛋白介导的受体内吞），但明显加速了DNs的摄取速度，证明DNA纳米材料进入细胞的过程可以被培养环境中的蛋白等生物分子所调控的。本研究结果为以DNs为基础的DNA纳米载体的进一步设计和优化提供了参考。

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