植物抗病毒基因工程研究进展

摘要 简要介绍了植物病毒病害及植物的抗病机制，综述了植物抗病毒基因工程的研究进展，包括利用病毒基因、利用植物自身的抗病毒基因、干扰素基因、抗体基因和多基因策略等，并对其以后的发展进行了展望。

关键词 病毒；抗病机制；基因工程

中图分类号 Q789文献标识码A文章编号1007-5739（2008）16-0317-02

植物病毒病是农作物的主要病害，目前约有1 000多种植物病毒病已被世人所认识。每年全世界的农作物因病毒侵害的损失高达200亿美元，对农业生产构成了严重的威胁。因此，植物病毒病的防治早已是农业工作者关注和研究的重要对象，现在已发展了多种防治策略来控制这类病害，例如培育抗病品种、施用化学杀菌剂、切断病毒的感染途径、组织脱毒、农业防治等，但都无法从根本上减轻病毒病的危害。近年来，以基因工程技术为先导的分子生物技术的研究，大大丰富了人们对生命过程和本质的认识，开辟了植物抗病育种的新途径。

1利用病毒基因

1.1外壳蛋白基因

该策略主要是将病毒的衣壳蛋白（CP）基因进行体外克隆，体外重组及构建表达盒，然后将重组的CP基因转化到植物细胞内，使CP基因在植物体内得以表达，从而使转基因植物获得抗病毒或相关病毒侵染的能力。1986年Powell等首次将烟草花叶病毒（TMV）外壳蛋白基因（CP基因）导入烟草植株，开创了抗病毒育种的新纪元。这一策略已被广泛应用于其他众多的转基因植物，关于CP基因所介导的抗性机理主要有4种：①认为抗性的产生是由于CP的表达抑制了病毒的脱壳；②认为抗性的产生是CP干扰了病毒RNA的复制；③认为抗性的产生是由于CP限制了病毒粒体的扩展与转运 ；④ 认为抗性的产生是由于CP基因所表达的mRNA与侵入病毒RNA之间相互作用的结果。事实上，外壳蛋白基因介导的抗性的作用机制目前还不十分清楚，一般都是研究者对于不同的病毒外壳蛋白基因介导的抗性机制提出的不同假设。

1.2移动蛋白基因

植物病毒系统侵染寄主经过2个明显的过程：病毒通过胞间连丝在细胞间的移动和通过维管束系统在器官间的转移。病毒在细胞间的移动，主要受病毒本身编码的移动蛋白（movement protion，MP）和寄主因素所控制。MP一方面能够修饰胞间连丝，而增加其有效孔径；另一方面能结合病毒核酸，使病毒核酸的三维结构改变成丝状的核酸—蛋白质复合体，这一复合体使病毒较容易地通过胞间连丝。目前，对MP基因的应用主要是将其克隆，经缺失改造后转化植株，使转基因植株对病毒产生抗性。这类抗性是广谱性的。Cooper等将TMV 的MP基因缺失后导入烟草，转基因植株不仅对同一属的多种病毒具有抗性，而且还对烟草脆裂病毒（TRV）、黄瓜花叶病毒（CMV）等也有抗性。关于其抗病机理，一般认为转基因植物缺失型MP和植物病毒正常的MP与寄主细胞的胞间连丝有共同结合位点，在转基因植物中，转基因所表达的缺失型MP与细胞胞间连丝结合、修饰，占据了胞间连丝上的病毒MP的结合位点，当病毒侵入细胞时，病毒正常的MP就失去了与胞间连丝结合的机会，从而阻碍了病毒在细胞间的移动。

1.3RNA介导的抗性策略

RNA水平的抗性策略主要有卫星RNA和缺陷干扰RNA。

（1）卫星RNA基因策略。卫星RNA是依赖于病毒才能复制的一类低分子量RNA，而它本身对于辅助病毒的复制并非必需的。卫星RNA对植物病毒的影响主要有3类：①加重症状；②无调节作用；③减轻症状。Baulcombc等将CMV卫星RNA的克隆转入烟草。在转基因植株上接种CMV，发现有大量单位长度的卫星RNA产生，而病毒基因组RNA减少了95%，且只在第1~3片叶上形成斑驳，此后形成的叶片不表现花叶症状，接近正常植株。一般认为其作用机制是卫星RNA与病毒基因RNA争夺病毒RNA复制酶，由于卫星RNA分子小，复制量远远大于基因组RNA的复制量，大量的卫星RNA占据复制酶，必然会使病毒基因组的复制减少，从而达到干扰病毒基因组复制的目的。

（2）缺陷干扰RNA。缺陷干扰型RNA（defectiveinterfering RNAs，DI-RNAs）是指那些直接来源于病毒的核酸序列，其所含的基因比正常病毒基因短小，但是核酶两端以及复制起点等都和正常病毒有相同的RNA分子。当缺陷RNAs和正常病毒感染同一细胞时，缺陷RNAs可迅速增殖，利用正义RNA去竞争病毒复制酶的结合位点，干扰了正常病毒的复制，限制了病毒的扩散。Huntley等用雀麦草花叶病毒不同片段的核酸，重组成缺陷RNA后导入水稻，转基因植株表现出抗病毒的特性，但这一策略具有潜在危险性，因为在转基因植株内发生RNA重组时，有可能产生新的病毒。

2利用植物自身的抗病毒基因

上述抗病毒方法都源于病毒基因组，与此同时，植物在其长期的进化过程中也逐渐获得了一系列复杂的防御机制来保护自己，如过敏性反应、免疫性等。长期以来，人们一直在寻找这种植物自身的抗病毒基因，并取得了一定的进展。

2.1病程相关蛋白基因

植物受病毒或其它病原体感染时产生的过敏反应所诱发的防御反应主要是以植物编码的病程相关蛋白（Patho genesis-related protein，PR）为物质基础的，至少包括以下3个方面：直接对病原体进行攻击（如诱导产生的水解酶类）；宿主代谢调整以适应过激条件（如过氧化物歧化酶）；将病原体局限于侵染的位点（如木质化酶等酶类）。如果将这些基因分离出来用于抗病毒基因工程，则可能提高工程植株本身内在的抗性，也有人认为抗性并不是靠PR的单独作用，而是它们共同作用的结果。虽然目前转PR基因植物的抗性水平并不理想，但随着植物防御机制的深入研究，这种抗病毒手段应该具有很好的应用前景。

2.2潜在自杀基因

该策略的思路是：将植物来源的毒素蛋白（如抗病毒蛋白等）基因克隆到某种病毒的启动子下游，再将这一重组体以反义形式克隆到植物表达载体中并转化植物。植物体内转录出包含病毒启动子与该病毒蛋白在内的复合物，但不会翻译表达有功能的活性毒素蛋白。然而，一旦该种病毒侵染植物，其体内已经转录出的反义RNA会利用病毒酶系统转录出正义链的mRNA，mRNA再翻译表达则产生有功能的活性毒素蛋白，结果病毒侵染了的细胞死亡而邻近的细胞不受影响。

2.3抗TMV的N基因

在植物诱导抗性中过敏性坏死斑反应是一些植物对某些病毒侵染的一种强烈的抗病反应，它被认为是抗病的标志，如将烟草花叶病毒（TMV）接种到心叶烟上，则在接种的叶片上产生坏死斑反应，过敏性坏死斑形成是由于植物内含有一控制坏死斑反应的基因，即N基因的存在造成的，因大多数过敏性坏死斑反应是由单个基因控制的，易被克隆利用，例如人们已成功地将N基因克隆，转入番茄植株，获得的转基因番茄对TMV表现为强烈的过敏性反应。

3干扰素基因

它是一种小分子量蛋白质，是脊椎动物在受病毒感染后分泌的一种蛋白，能结合在细胞质膜上，形式抗病毒结构，它可以提供广泛抗病毒特性，Truc等把大白鼠编码的干扰素之一的3’、5’寡腺苷酸合成酶的DNA导入马铃薯植株，攻毒试验表明转基因植物内病毒浓度显著低于未转化的对照。我国已进行了一干扰素基因导入烟草和水稻，并得到了表达，表达的干扰素具有抗病毒活性。

4抗体基因

医学界抗体基因工程与植物生物技术相结合，导致了植物抗体的产生，为规模化、经济有效地制备医用治疗性抗体开辟了新的途径，并且应用这一策略已取得了可喜的成绩。人们根据免疫学原理并利用医学界已取得的成就，将某一植物病毒的抗体基因转入植物体内，使其充分表达，来抵御相关病毒的入侵，从而达到防治植物病毒病的目的。Tavladoraki等将抗菊芋花斑皱叶病毒（AMCV）的外壳蛋白单链抗体（sc）的可变区（Fv）基因转入烟草后，发现转基因植株表现出抗AMCV的功能。表达TMV的全抗体基因的转基因植株，用TMV攻毒时，与未转基因的对照相比，其坏死病斑的数量下降了70%，且下降水平与抗体的分泌水平有关。研究证明，植物体内能生产从小分子抗体到全抗体等各种工程抗体，因此，这种将某一病毒的抗体基因转入植物体内使其充分表达而抵御相关病毒入侵的方法具有好的发展前景。

5多基因策略

以上方法所利用的都是单一的抗性基因，而且大多是针对某一种病毒的某一步侵染过程来设计的，因而其抗性多具有较强的专化性和局限性。然而，在自然条件下，RNA病毒有相当高的突变率，突变株的不断进化可能会导致抗性的丧失，那么，如何才能有效地增强工程植株的抗性呢？此外又该如何防御田间多种病毒的混合侵染？采用复合抗性基因的策略不失为一个可行的解决方案。多基因策略即是利用多个抗性基因共同作用或相互作用，从多条途径来破坏病毒基因组的功能表达，从而达到有效防治病毒的目的。

近年来，这方面的试验已经有了成功的例子。例如：在抗CMV 的研究中，人们发现，用CMV CP基因与卫星RNA中的任何一种单独转化植物，都难以获得良好的效果，Yie等人将CMV CP基因与卫星RNA构建到同一植物表达载体中转化植物，结果获得了高抗工程植株。这些试验结果有力地证明了该策略的可行性和有效性。

6结语

基因工程为植物抗病毒研究注入了新鲜血液，开辟了一个全新的领域。不难看出，自1986年诞生第1株抗病毒工程植株以来，植物抗病毒基因工程研究不论在深度上还是广度上都进展迅速，成绩喜人。在各种策略中，以病毒来源的基固介导的抗性取得的成就最大。但病毒来源的基因介导的病毒抗性通常具有株系专化性，而在自然条件下，RNA病毒有相当高的突变频率，突变株的不断进化可能会导致抗性的丧失。此外，田间多种病毒的混合侵染也是一个潜在的障碍，因而，其作用效果还不足以达到推广应用的水平。随着对病毒与植物相互作用机制的深入了解和基因工程技术的发展，植物抗病毒基因工程必将不断取得突破性的进展，最终发展成高效而安全的防治病毒的手段。

7参考文献

[1] 林忠平．走向21世纪的植物分子生物学[M]．北京：科学出版社，2000.

[2] 张海燕.获得病毒抗性的植物基因工程策略及其抗病机理研究进展[J]．武汉植物学研究，1997（17）：15-24.

[3] 蒋军喜，蔡祝南．卫星RNA在调节植物病毒病害症状中的作用[J]．江西农业学报，1999，11（3）：60-64.

[4] 郭兴启，尚念科．植物抗病毒基因工程育种策略及其进展[J]．生命科学研究，2000，4（2）：112-117.

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