牛源性大肠杆菌乳腺炎模型大鼠与血清白细胞介素18的相关性

材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种

致病性大肠杆菌自奶牛乳汁中分离，鉴定后保存备用。

1.1.2供试大鼠

试验动物为产后10～14 d的SD大鼠，体质量为（278.50）g。将56只母鼠随机分为6个试验组和1个对照组。

1.1.3仪器与试剂

营养肉汤培养基、琼脂培养基、血琼脂培养基购自广东环凯微生物科技有限公司。高压蒸汽灭菌器，电子天平（梅特勒），超净工作台（上海值欧净化科技有限公司），YM100Z型立式压力蒸汽灭菌器，微量注射器，台式高速离心机，CX22LED型显微镜（奥林巴斯），IL-18试剂盒等。

1.2方法

1.2.1菌液的配制

大肠杆菌从河南省郑州市患有乳腺炎的奶牛乳汁中分离，在肉汤培养基中培养纯化，然后配成大肠杆菌菌液，加入30%的灭菌甘油，于-80 ℃下冷凍保存。使用前解冻接种肉汤培养基，纯化并采用平板计数法进行细菌计数。按照梯度稀释法，采用灭菌生理盐水将细菌配成浓度为2×104、2×105、2×106、2×107、2×108、2×109 CFU/mL的细菌悬液，于4 ℃下保存备用。

1.2.2接种大鼠

将分娩后10～14 d的母鼠随机分为A组（2×104 CFU/mL）、B组（2×105 CFU/mL）、C组（2×106 CFU/mL）、D组（2×107 CFU/mL）、E组（2×108 CFU/mL）、F组（2×109 CFU/mL）。挤奶后，分别取0.5 mL上述不同浓度的大肠杆菌悬液，采用微量注射器在第4乳区对称注入乳房，对照组注射等量的灭菌生理盐水，注射后轻揉。

1.2.3样品的采集

分别于注射菌液后6、12 h及1、2、3、5、7 d观察临床症状并进行乙醚吸入麻醉，每次各组取1只大鼠，静脉采血进行血常规检查和分离血清，解剖摘取大鼠的脾脏和胸腺，称质量并计算脾脏和胸腺指数。采用ELISA方法检测IL-18，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3统计学方法

采用SPSS 19.0统计分析软件对试验数据进行统计分析。计量数据采用t检验，以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2结果与分析

2.1大鼠乳腺炎模型的临床症状和生理指标

注射菌液6 h后，D、E、F组部分大鼠出现精神沉郁、饮食减少；12 h后，部分大鼠乳房局部温度升高，剖检可见乳腺肿胀和充血；12～24 h D组大鼠死亡1只，F组大鼠死亡3只，通过解剖发现，此阶段攻毒组大鼠的临床症状最为明显；48 h后症状逐渐减轻。本试验中未感染的大鼠共2只，均为A组。根据乳腺组织中细菌数量的检测和计算，A组的注射细菌数量为轻度乳腺炎（<2×105 CFU/mL），B、C、D组为中度乳腺炎（2×105～2×108 CFU/mL），E、F组为重度乳腺炎（>2×108 CFU/mL）。建立牛源性大肠杆菌乳腺炎大鼠模型，注射细菌的数量应控制在2×105～2×107 CFU/mL。

2.2牛源性大肠杆菌乳腺炎大鼠模型血清IL-18水平的表达

由表1可知，牛源性大肠杆菌乳腺炎与血清IL-18水平密切相关，乳腺炎组大鼠的血清IL-18水平明显高于对照组，且差异极显著（P<0.01）。随着乳腺炎发病程度的不同，血清IL-18水平表达也不同，重度乳腺炎的血清IL-18水平显著高于轻度乳腺炎，且差异极显著（P<0.01）。注射大肠杆菌的时间不同，血清IL-18水平表达也不同，48 h的血清IL-18水平升至最高，之后逐渐下降，但没有统计学意义（P>0.05）。

3结论与讨论

3.1大鼠乳腺炎模型的构建

肠杆菌性乳腺炎的致病微生物包括埃希氏大肠杆菌、克雷伯氏杆菌、肠杆菌等，均为环境因素导致乳房炎的典型案例。感染来源于牛粪及污染的环境，牛舍过度潮湿、泥泞使肠杆菌大量持久地在环境中生存，易造成肠杆菌性乳房炎发生。

乳腺炎模型的构建最早起源于1970年，之后很多学者采用不同方法建立乳腺炎模型，以研究其发病机理和机制。钟凯等通过乳头注射金黄色葡萄球菌诱导建立大鼠乳腺炎模型；姚雪萍等建立了家兔乳腺炎模型；孙勇采用LPS诱发的乳腺炎建立了小鼠模型[2]。本试验从奶牛乳腺炎病例中检测出致病性大肠杆菌，通过培养和鉴定，将其以不同剂量接种于分娩10～14 d的大鼠。结果表明，建立大肠杆菌乳腺炎大鼠模型的注射细菌应控制在2×105～2×107 CFU/mL。本研究成功建立了牛源性大肠杆菌乳腺炎模型，为临床上大肠杆菌引起乳腺炎的预防和治疗提供依据。

3.2大鼠乳腺炎模型临床指标的变化

经乳头管向大鼠乳头内注射不同数量的牛源性大肠杆菌，均可引起乳腺的感染，但在不同注射数量和时间下大鼠的临床指标表现不同。注射大肠杆菌后，部分大鼠出现精神沉郁、饮食减少、体温显著升高的现象，于12 h后解剖大鼠，可见部分大鼠的乳腺组织出现充血红肿、变硬。通过解剖和临床症状观察可知，注射牛源性大肠杆菌的菌数为2×105～2×107 CFU/mL时，均可引起乳腺组织不同程度的炎症，且不同时间下炎症的程度不同。

3.3牛源性大肠杆菌乳腺炎大鼠模型的血清IL-18水平动态变化

[JP2]IL-18是一种新发现的细胞因子，在机体免疫调控中起着至关重要的作用，可刺激淋巴细胞产生TNF-α和IFN-γ，促使机体免疫力增强，在抗炎、抗菌、抗肿瘤方面发挥重要作用[8-9]。马露等通过猪脾淋巴细胞增殖试验和抗病毒活性检测发现，IL-18能有效抑制病毒的增殖[10]。张书起等以 IL-18作为疫苗佐剂，可明显增强小鼠的免疫力[11-12]。金元昌等对不同马立克氏病抗性的鸡进行攻毒后检测，结果表明，鸡 IL-18 基因的表达与马立克氏病抗性遗传性状相关[4-5]。关于乳腺炎IL-18水平相关性的研究国内报道很少。本试验对牛源性大肠杆菌大鼠乳腺炎模型的血清IL-18水平进行动态检测，结果表明，牛源性大肠杆菌乳腺炎与血清IL-18水平具有密切的相关性。乳腺炎组的血清IL-18水平明显高于对照组，且差异极显著（P<0.01），随着乳腺炎炎症程度的加重，血清IL-18水平表达明显升高，且差异极显著（P<0.01）。本试验为乳腺炎发病机理和抗病性的进一步研究提供了依据，并为IL-18的深入研究和应用提供了参考。

[HS2*2][HT8.5H]参考文献：[HT8.SS]

[1]余光涛. 大鼠乳腺金黄色葡萄球菌急性感染相关炎性细胞因子变化规律的研究[D]. 扬州：扬州大学，2014.

[2]孙勇. 栀子苷对LPS诱发的小鼠乳腺炎性损伤保护效果的研究[D]. 长春：吉林大学，2014.

[3]付明哲，李长安，魏拣选，等. 陕西奶牛隐性乳腺炎病原菌的自动鉴定和耐药性分析[J]. 中国兽医杂志，2014，50（9）：38-41.

[HT8.]

[4]金元昌，李玉峰，张艳. 不同马立克氏病抗性鸡攻毒后IL-18基因的差异表达[J]. 中国兽医学报，2015，35（3）：355-357.

[5]马全英，祝秀梅，安芳兰. 白细胞介素18研究进展[J]. 贵州畜牧兽医，2014，38（2）：21-24.

[6]钟凯，王艳玲，邹思湘，等. 乳头管灌注内毒素诱发大鼠实验性乳腺炎模型的建立[J]. 农业生物技术学报，2005，13（5）：654-658.

[7]姚雪萍，杨德英，杨洪森，等. 乳头管灌注金黄色葡萄球菌对家兔血清中酶活性的影响[J]. 中国畜牧兽医，2010，37（2）：59-61.

[8]Reinhardt T A，Sacco R E，Nonnecke B J，et al. Bovine milk proteome：quantitative changes in normal milk exosomes，milk fat globule membranes and whey proteomes resulting from Staphylococcus aureusmastitis[J]. Journal of Proteomics，2013，82：141-154.

[9]劉娟，姚天佑，孔莺莺，等. NAD+抑制脂多糖诱导海马炎症因子的表达[J]. 扬州大学学报：农业与生命科学版，2016，37（1）：16-21.

[10][JP3]马露，乔薪瑗，唐丽杰，等. 猪IL-18在乳酸乳球菌中的表达及其[JP2]生物活性的检测[J]. 生物工程学报，2014，30（10）：1541-1548.

[11]张书起，于洪川，张春良，等. 大鼠试验性乳房炎病理模型[J]. 农业科学研究，2006，27（4）：27-31.

[12]李静杰. 哈尔滨周边地区奶牛隐性乳腺炎的流行病学调查[J]. 养殖技术顾问，2015（1）：58.

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